单端孢菌素逆转肺癌耐药A549/DDP细胞耐药性及其机制研究

目的 探讨单端孢菌素对肺癌耐顺铂细胞系A549/DDP顺铂耐药性的逆转作用及机制。方法 应用MTS法检测单端孢菌素对A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测肿瘤细胞表面P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-pg）表达以及胞内罗丹明-123（Rhodamine-123,Rh-123）含量的变化,生化法检测细胞内SOD和GSH的水平,Western blot法和Real time PCR检测肿瘤细胞多药耐药蛋白MDR1、MRP1和Survivin表达的变化,Western blot法检测Akt磷酸化的变化,液相芯片法检测TGF-β,IL-6和IL-8的变化,应用双萤光报告基因技术检测细胞NF-κB和AP-1转录活性。结果 单端孢菌素可增加细胞对顺铂的敏感性,经5 μg·mL^-1和10 μg·mL^-1单端孢菌素作用72 h后,耐药逆转倍数（RF）为1.84和3.95倍。经5 μg·mL^-1和10 μg·mL^-1单端孢菌素作用24 h后,肿瘤细胞P-gp表达分别下降了62.6%和19.8%,细胞中Rh-123含量分别提高了183.3%和308.3%,细胞内SOD水平下降65.2%和50.1%,GSH水平下降 71.6%和46.3%,MDR1的mRNA水平下降了72.7%和52.3%,MRP1的mRNA水平下降了64.0%和22.5%,Survivin的mRNA水平下降了45.8%和14.7%,Akt磷酸化水平下降,TGF-β分泌水平下降了80.2%和51.5%,IL-6分泌水平下降了73.4%和37.2%,IL-8分泌水平下降了71.2%和43.2%,NF-κB转录活性下降42.3%和22.7%,AP-1的转录活性下降了57.4%和32.5%。结论 单端孢菌素逆转A549/DDP对顺铂的耐药性,这一作用与抑制药物外排,负调控肿瘤耐药相关蛋白的表达有关。     

Src激酶抑制剂对人肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP多药耐药性的影响及机制

目的研究Src激酶抑制剂PP2对人肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP多药耐药性的影响及机制。方法以5和10μmol.L-1Src激酶抑制剂PP2作用A549/DDP细胞24h后,应用Western blot考察肿瘤细胞Src磷酸化表达的变化,MTT法检测细胞的药物敏感性,流式细胞仪考察细胞P-gp表达的变化,Western blot及Real-time PCR考察肿瘤细胞MDR1蛋白及mRNA表达的变化。结果 Src激酶抑制剂PP2可下调A549/DDP细胞Src磷酸化表达,5和10μmol.L-1 Src激酶抑制剂PP2作用后,顺铂对A549/DDP细胞的药物敏感性分别提高了1.37和2.47倍,细胞P-gp表达分别为对照组的65.2%和46.4%,MDR1在蛋白水平表达显著降低,MDR1在mRNA水平的表达分别为对照组的50.24%(P<0.05)和37.6%(P<0.05)。结论 Src激酶抑制剂PP2可逆转A549/DDP细胞多药耐药性,其机制可能与降低细胞MDR1表达水平有关。     

三苯氧胺对肺癌A549/DDP细胞多药耐药性的逆转作用及机制

目的探讨三苯氧胺（TAM）逆转肺癌A549/DDP细胞多药耐药性（MDR）的作用及可能机制。方法以噻唑蓝（MTT）比色法测定TAM对A549/DDP细胞的生长抑制率,流式细胞术检测TAM对A549/DDP细胞内Rho123表达的影响,选取最佳的TAM实验浓度。以MTT法检测TAM对阿霉素（ADM）、吉西他滨（GEM）、顺铂（DDP）的逆转效率,即时聚合酶链反应法检测TAM对A549/DDP细胞多药耐药基因1（MDR1）mRNA水平的变化,蛋白质印迹法检测P糖蛋白（P-gp）表达水平的变化。结果 TAM剂量在10.0μmol/L时对A549/DDP细胞毒性小且可增加细胞内Rho123的蓄积,10.0μmol/L的TAM能增加化疗药物的敏感性,对ADM、GEM、DDP的逆转倍数分别为3.0、7.2、2.0倍,使MDR1 mRNA的表达率较用药前下降35%,并可显著抑制P-gp的表达水平。结论 TAM体外可逆转A549/DDP细胞MDR,提高A549/DDP细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与抑制MDR1表达、减少细胞内药物外排有关。     

荜茇酰胺对人肺癌A549/DDP细胞耐药性的逆转作用

目的:研究荜茇酰胺对人肺癌A549/顺铂(DDP)细胞耐药性的逆转作用。方法:A549/DDP细胞经0、20、30μmol/L荜茇酰胺作用48 h后,用MTS法检测肿瘤细胞抑制率;流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡、细胞周期、P-糖蛋白(P-gp)表达和肿瘤细胞内罗丹明Rht123含量的变化;Western blotting法检测多药耐药基因(MDR)1、多药耐药相关蛋白(MRP)1、DNA拓扑异构酶(Top)Ⅱ、谷胱甘肽S-转移酶(GST)-π、凋亡抑制蛋白Survivin、周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)1和蛋白激酶(PK)Cζ蛋白表达;实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MDR1、MRP1、Top-II、GST-π、Survivin和CDK1 m RNA表达;酶标仪检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、8活性。结果:A549/DDP细胞经0、20、30μmol/L荜茇酰胺作用48 h后,DDP对肿瘤细胞增殖的抑制率明显升高;与0μmol/L比较,20、30μmol/L荜茇酰胺作用48 h后,DDP导致的细胞凋亡率和G2期/M期明显升高,P-gp表达明显减弱,Rh-123浓度明显增加,MDR1、MRP1、Top-II、GST-π、Survivin、CDK1和PKCζ蛋白表达明显减弱,MDR1、MRP1、Top-Ⅱ、GST-π、Survivin、CDK m RNA表达明显减弱,Caspase-3、8的活性明显增强。结论:荜茇酰胺可逆转人肺癌A549/DDP细胞DDP耐药性,可能与其调节多药耐药相关基因表达有关。     

温下方逆转A549/DDP细胞的多药耐药及对膜表面蛋白表达的影响

目的运用血清药理学方法,体外研究温下方对A549/DDP细胞多药耐药的逆转作用及机制。方法正常血清及不同浓度的温下方含药血清作用于A549/DDP细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测温下方含药血清对A549/DDP细胞的逆转作用;运用免疫荧光技术,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测肺耐药相关蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和P-糖蛋白(P-gp)的表达。结果温下方含药血清能明显逆转A549/DDP细胞的多药耐药,增敏倍数为2～2.5倍。并可明显降低P-gp、LRP、MRP蛋白表达。结论温下方通过降低P-gp、LRP、MRP的表达以增强A549/DDP对化疗药的敏感性,逆转肺腺癌细胞的多药耐药。     

雷公藤甲素在调控人鼻咽癌转移相关基因中的作用及机制

目的 探讨雷公藤甲素在调控人鼻咽癌转移相关基因中的作用及机制.方法 人鼻咽癌CNE1细胞经雷公藤甲素处理后,通过Western blot试验考察肿瘤细胞E-cadherin、MMP-2/9及p-Akt蛋白表达的变化,Real-time PCR试验考察肿瘤细胞E-cadherin和MMP-2/9 mRNA表达的变化,报告基因试验考察NF-κb启动子活性的变化.结果 CNE1细胞经过5和10 μmol.L-1雷公藤甲素处理24 h后,MMP-2/9及p-Akt蛋白表达显著下降,E-cadherin蛋白表达显著上调;mRNA表达MMP-2分别下降69.1%和37.4%(P＜0.05),MMP-9分别下降83.2%和35.2%(P＜0.05),E-cadherin分别上调132.8%和155.6%(P＜0.05),NF-κb启动子活性分别下降51.2%和34.8%(P＜0.05).结论 雷公藤甲素可抑制人鼻咽癌CNE1人鼻咽癌转移相关基因表达,其机制可能与其下调细胞NF-κb启动子活性有关.     

PJ34对肺腺癌顺铂耐药细胞增殖及耐药性的影响

目的探讨第3代选择性PARP-1抑制剂PJ34对肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP生长活性及耐药性的影响。方法使用不同浓度梯度的顺铂(DDP)、PJ34单药或联合作用于A549/DDP细胞,MTT法检测各药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞内PARP-1蛋白、MDR相关蛋白(LRP、GST-π)的表达水平。结果PJ34单药对A549/DDP细胞有明显的抑制作用,无毒剂量的PJ34可明显增强A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,诱导细胞凋亡,使细胞内PARP-1蛋白、MDR相关蛋白(LRP、GST-π)的表达水平明显降低。结论 A549/DDP细胞的顺铂耐药性与细胞内PARP-1蛋白的过度表达有关,PJ34有明显的顺铂增敏作用,能部分逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,其机制可能与诱导细胞凋亡,降低细胞内LRP、GST-π的蛋白表达水平有关。     

双氢青蒿素通过PI3K/Akt通路逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞的分子机制

摘要：目的:研究双氢青蒿素通过磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞的分子机制。方法:体外培养人肺癌耐顺铂株（A549/DDP）,给予不同浓度双氢青蒿素(20,40,80,160,200,250,300μmol·L-1)处理48 h后,通过MTT法检测双氢青蒿素对A549/DDP细胞增殖影响,选取双氢青蒿素最佳实验浓度及在不同浓度DDP(0,20,40,60,80,100μmol·L-1)作用下观察并计算顺铂对A549/DDP细胞IC50和双氢青蒿素对A549/DDP逆转倍数;通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中凋亡相关因子B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）及PI3K/Akt通路相关蛋白PI3K、AKT、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表达。结果:随双氢青蒿素浓度升高,细胞增殖抑制率依次升高（P<0.05）,且具有浓度依赖性,IC10（32.07±1.04）μmol·L-1是双氢青蒿素为最佳逆转耐药浓度;随DDP浓度的升高,双氢青蒿素A549/DDP细胞增殖抑制率随之升高（P<0.05）,DDP+双氢青蒿素组顺铂对A549/DDP的IC50为（26.42±1.23）μmol·L-1,顺铂组为（58.16±1.32）μmol·L-1,双氢青蒿素的逆转耐药倍数为2.21;与对照组相比,DDP组、双氢青蒿素组、DDP+双氢青蒿素组细胞凋亡率、caspase-3表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt表达显著降低（P<0.05）;与DDP组、双氢青蒿素组相比,DDP+双氢青蒿素组细胞凋亡率、caspase-3表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt表达显著降低（P<0.05）。结论:双氢青蒿素通过抑制PI3K/Akt通路促进A549/DDP细胞凋亡,在一定程度上可逆转肺癌A549/DDP细胞株对顺铂的耐药性。     

异长春花碱对耐顺铂人鼻咽癌细胞多药耐药的逆转作用及其机制

目的:研究异长春花碱对耐顺铂(DDP)人鼻咽癌细胞(CNE2/DDP)多药耐药的逆转作用及其机制。方法:以对数生长期的CNE2/DDP细胞为对象,检测0.1、1、5、10、50、100μmol/L异长春花碱作用24 h后细胞的增殖抑制率,与空白对照组比较考察5、10μmol/L异长春花碱对细胞耐DDP的逆转倍数(RF)、细胞内罗丹明123的含量、多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)mRNA及其蛋白表达和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)蛋白表达、激活蛋白1(AP-1)活性。结果:异长春花碱与剂量呈正相关地抑制CNE2/DDP细胞的增殖;5、10μmol/L异长春花碱对细胞耐DDP的RF分别为2.81、8.38倍;与空白对照组比较,细胞中罗丹明123含量分别提高了2.16和2.79倍(P<0.05),MDR1、MRP1 mRNA及其蛋白,p-JNK蛋白和AP-1活性均明显降低(P<0.05)。结论:异长春花碱可逆转CNE2/DDP细胞对DDP的耐药性,降低细胞中MDR1、MRP1的表达,其机制可能与抑制JNK磷酸化、下调AP-1活性有关。     

瓦他拉尼对乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药的逆转研究

目的观察新型激酶抑制剂类抗癌药瓦他拉尼(vatalanib)逆转肿瘤细胞多药耐药(MDR)的效果,研究其对乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的作用,探讨其作用机制。方法应用MTS法或SRB法检测瓦他拉尼对耐药细胞与敏感细胞的细胞毒性和逆转MDR的效果;分别以罗丹明(Rh-123)、米托蒽醌(MX)、阿霉素(ADR)为P-gp、BCRP、MRP1的荧光底物,应用流式细胞术检测该药对P-gp、BCRP、MRP1外排功能的影响;应用Western blot检测该药对耐药细胞中BCRP蛋白表达水平的影响,并研究其对细胞增殖相关信号分子的影响;应用qRT-PCR检测其对耐药细胞中BCRP基因表达水平的影响;通过超速离心法制备BCRP转运蛋白的粗膜,检测瓦他拉尼对BCRP的ATPase活性的影响。结果无毒剂量的瓦他拉尼(5μmol·L-1)可有效逆转BCRP高表达的肿瘤细胞株HEK293/ABCG2对MX、ADR和托泊替康(TOPT)的耐药,而对P-gp高表达的肿瘤细胞株K562/A02和MRP1高表达的肿瘤细胞株HEK293/ABCC1的耐药无逆转作用。该药能够下调耐药肿瘤细胞的BCRP基因和蛋白的表达水平,并具有时间和剂量依赖效应,但对BCRP外排MX的功能无明显抑制作用。该药可以激活BCRP的ATPase活性,但并不改变BCRP的构象,对耐药和敏感细胞中AKT和ERK的表达及其磷酸化水平也均无明显影响。结论瓦他拉尼可有效、特异地逆转BCRP介导的肿瘤MDR,其机制可能是通过下调耐药肿瘤细胞中BCRP基因和蛋白的表达来达到逆转MDR的效果。     

四氢异喹啉类化合物HZ08逆转白血病K562/DOX细胞多药耐药性的试验研究

目的:探讨四氢异喹啉类化合物HZ08对人白血病多药耐药K562/DOX细胞的逆转作用及其可能的机制。方法:采用MTT法检测HZ08的体外细胞毒性及其对阿霉素(DOX)的增敏作用,采用逆转倍数(RF)值评价其逆转效果;应用流式细胞仪分析细胞内罗丹明123(Rh123)潴留量的变化和DOX浓度,评价P糖蛋白(P-gp)的功能;采用Western blot法及免疫细胞化学法测定mdr1基因产物P-gp的表达;同时以人白血病敏感细胞株K562/S细胞为对照进行比较试验。结果:与K562/S细胞比较,HZ08可明显增强DOX对K562/DOX的细胞毒性,RF值增加;HZ08能浓度相关性地增加K562/DOX细胞对Rh123的摄取以及细胞内Rh123的潴留,明显抑制P-gp介导的Rh123外排;K562/DOX细胞膜上P-gp呈强阳性表达,但HZ08对K562/DOX细胞P-gp表达水平无明显影响;HZ08可显著增加K562/DOX细胞内DOX浓度。结论:HZ08可通过抑制K562/DOX细胞P-gp的功能、增加耐药细胞内DOX的浓度而增强K562/DOX细胞对DOX的敏感性,其可能成为有效的多药耐药逆转剂的候选药物。     

Ezrin在胃癌组织中的表达及与P-gp、GST-π、LRP的关系

目的检测埃兹蛋白(Ezrin)、P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶π(GST-π)和肺耐药相关蛋白(LRP)在胃癌组织中的表达,并对Ezrin在胃癌多药耐药(MDR)中的意义进行分析。方法对52例胃癌和36例癌旁组织标本进行免疫组化染色,检测Ezrin与P-gp、GST-π在两种组织中的表达情况。结果胃癌组织中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP表达均比癌旁组织增强(P<0.05)。相关分析显示,胃癌组织中Ezrin与P-gp表达存在正相关关系(r=0.3385,P=0.0141),Ezrin与LRP表达存在正相关关系(r=0.3072,P=0.0267),P-gp与LRP表达存在正相关关系(r=0.2986,P=0.0315)。结论 Ezrin在胃癌组织中表达增强,Ezrin可能通过调节P-gp、LRP表达而参与胃癌MDR。     

急性白血病患者体外药敏结合多药耐药基因MDR1、MRP及LRP与临床疗效的相关性研究

目的:分析体外药敏结合多药耐药基因MDR1、MRP及LRP与急性白血病患者临床疗效间的相关性,并研究三者间的内在联系,为临床个体化给药提供依据。方法:前瞻性收集2010年2-7月收住我院血液科的急性白血病患者35例,同时采用ATP-TCA对其进行体外药敏试验和RT-PCR对其进行多药耐药基因MDR1、MRP及LRP的检测。结果:体外药敏与临床疗效的总符合率85.7%,阴性符合率50.0%,阳性符合率90.3%,灵敏度93.3%,特异度40.0%。MDR1、MRP及LRP均表达阴性者23例,占65.7%,MDR1、MRP及LRP均表达阳性者2例,占5.7%,其中MDR1阴性者有效率93.3%,MDR1阳性者有效率40.0%(P<0.01);MRP阴性者有效率89.7%,MRP阳性者有效率66.7%(P>0.05);LRP阴性者有效率92.6%,LRP阳性者有效率62.5%(P<0.05)。23例体外药敏敏感且MDR1、MRP及LRP均为阴性的患者中有21例临床缓解,临床有效率为91.3%(21/23),2例体外药敏耐药且MDR1、MRP及LRP均为阳性者无1例临床缓解,临床有效率为0(0/2)。结论:同时进行体外药敏和MDR1、MRP及LRP的检测可更好地预测急性白血病患者的预后,并作为急性白血病患者个体化给药的实验室依据。