小干扰RNA阻抑人端粒酶催化亚基基因表达对肾癌细胞增殖及凋亡的影响

为研究RNA干扰对肾癌基因治疗作用，2004年本研究以针对人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transeriptase，hTERT)基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染肾透明细胞癌株786-0细胞，观察其对786-0细胞hTERT表达及增殖、凋亡的影响。     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌细胞Ki67基因表达及其增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞增殖基因Ki67表达及其增殖、凋亡的影响。方法将Ki67 siRNA(100 nmol/L)转染人肾癌786-0细胞。采用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化技术检测Ki67 mRNA及蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果Ki67 siRNA处理组786-0细胞Ki67 mRNA表达(37．6±1．9)%、Ki67蛋白表达(46．4±0．9)%、免疫组化Ki67表达吸光度(A)值52．5±2．3,阴性siRNA对照组分别为(97．3±0．9)%、(95．3±0．9)%、114．5±4．9,2组比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。Ki67 siRNA处理组细胞增殖抑制率(63．6±1．6)%、凋亡细胞阳性率(41．7±0．6)%,阴性siRNA对照组分别为(2．8±0．2)%、(10．3±1．4)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0．01)。结论肿瘤增殖基因Ki67 siRNA能抑制人肾癌786-0细胞Ki67基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

增殖及非增殖腺病毒载体介导的RNA干扰对肾癌细胞杀伤作用

目的比较荷载Ki67基因小干扰RNA（Ki67-siRNA）的增殖腺病毒ZD55-Ki67及非增殖腺病毒Ad-Ki67对肾癌细胞的杀伤作用。方法MOI=10的ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染肾癌786-0细胞，2d后收集细胞，蛋白印迹法检测E1A表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹法、免疫细胞化学法检测Ki67表达；原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡。4d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，7d后结晶紫染色法检测细胞毒性作用。结果感染ZD55-Ki67的786-0细胞表达E1A，感染Ad-Ki67的细胞不表达E1A。ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染的786-0细胞Ki67mRNA表达率分别为（37．9±2．3）％、（64．1±1．9）％；Ki67蛋白表达率分别为（42．5±2．4）％、（60．1±2．2）％；Ki67染色阳性率分别为（20．8±2．8）％、（32．3±2．5）％；786-0细胞存活率分别为（22．2±3．0）％、（60．4±3．4）％；凋亡率分别为（53．0±3．7）％、（35．3±2．5）％，两种病毒处理之间差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论ZD55．Ki67抑制786-0细胞Ki67表达及增殖、诱导凋亡及细胞毒性作用均显著优于Ad-Ki67。增殖腺病毒介导的RNA干扰杀伤肾癌细胞作用优于非增殖腺病毒。     

RNA干扰沉默STIL基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨STIL在胃癌中的表达以及沉默STIL基因对胃癌细胞株SGC-7901各生物学活性的影响.方法 采用实时定量PCR（qPCR）法和Western Blot法检测STIL在胃癌及癌旁组织中的表达.构建靶向STIL的SiRNA并转染SGC-7901细胞,以MTT法检测细胞增殖、平板克隆法检测细胞克隆形成,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 与癌旁组织相比,胃癌组织中STIL在mRNA和蛋白水平表达显著增高.与对照组相比,STIL特异性SiRNA（Si-STIL）转染后,SGC-7901细胞中STIL mRNA表达受到抑制,细胞增殖、克隆形成能力下降,凋亡增加,细胞周期被阻滞于S期.结论 STIL在胃癌组织中高表达,STIL基因沉默可抑制胃癌细胞生长和克隆增殖、抑制有丝分裂期（M期）转换,促进细胞凋亡.     

反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基(hTR)基因的序列结果，并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱，体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体，酶切鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，电镜观察细胞微观形态变化。结果实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后，10d凋亡率为11．10％。13d后凋亡率为29．02％。电镜下可见明显凋亡细胞。结论反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用；并抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞的凋亡；且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。     

反义人类端粒酶 RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用

目的 研究反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体对结直肠癌HT29细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。探讨以端粒酶为酸点的结直肠癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒，感染结直肠癌HT29细胞，采用RT-PCR检测hTR表达。端粒酶重复扩增法（telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测端粒酶活性，绘制生长曲线了解细胞生长状态，倒置显微镜观察和DNA片段电泳检测细胞凋亡。结果 反义hTR作用后的结直肠癌细胞hTR表达下降，端粒酶活性和细胞生长受到明显抑制，细胞出现凋亡。结论 反义hTR对结直肠癌HT29细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制人舰艇可能以hTR为靶点对结直肠癌进行基因治疗。     

PLK1基因siRNA的构建及对甲状腺未分化癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建保罗样激酶-1(PLK1)基因小干扰RNA(siRNA),并观察其对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计合成5个PLK1 siRNA(S1、S2、S3、S4、S5),转染人甲状腺癌ARO细胞后,采用实时定量RT-PCR方法筛选下调PLK1 mRNA效果最好的siRNA;然后以该siRNA转染ARO细胞后,分别以实时定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因表达情况;以MTT法检测对各组细胞增殖的影响;分别以caspase-3活性和TUNEL方法明确甲状腺癌细胞凋亡情况.结果 5个siRNA均明显下调PLK1 mRNA水平,以S4效果最好,抑制率达91.5%.MTr结果显示,S4 siRNA转染对甲状腺癌细胞增殖均有明显的抑制作用,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05).与对照组比较,S4 siRNA转染组癌细胞caspase-3活性明显升高,且呈浓度和时间依赖性(r=0.919;r=0.957);TUNEL结果显示,S4 siRNA转染组出现明显的凋亡现象,且呈浓度依赖性(r=0.932).结论 PLK1基因在甲状腺未分化癌细胞增殖中具有重要的调控作用.PLK1 siRNA转染可明显抑制癌细胞增殖,诱导凋亡是其重要机制之一.     

荷载hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒对人肾癌细胞增殖的抑制作用

目的 研究荷载hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒(ZD-hTERT)对肾癌Ketr-3细胞增殖抑制作用.方法 ZD-hTERT、溶瘤腺病毒ZD-EGFP、表达hTERT-siRNA的增殖缺陷腺病毒AdhTERT感染人肾癌Ketr-3细胞.Western blot检测E1A表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测hTERT表达;原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活;结晶紫染色法检测细胞毒作用.结果 感染ZD-hTERT、ZD-EGFP的Ketr-3细胞表达E1A;抑制hTERT表达作用依次为ZD-hTERT＞Ad-hTERT＞ZD-EGFP.感染ZD-hTERT、ZD-EGFP、AdhTERT的Ketr-3细胞凋亡率(%)分别为(65.9±1.4)、(26.5±2.8)、(16.3±3.2).感染ZDhTERT、ZD-EGFP、Ad-hTERT的Ketr-3细胞存活率(%)分别为(30.9±3.6)、(51.6±3.8)、(87.9±3.1),每种病毒之间差异有统计学意义(P＜0.01);对Ketr-3细胞的细胞毒作用ZD-hTERT＞ZD-EGFP＞Ad-hTERT.结论 表达hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒具有显著的抑制肾癌Ketr-3细胞hTERT基因表达、诱导凋亡、杀伤肾癌细胞作用.     

端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响

目的　探讨端粒酶反义核酸对肾癌细胞端粒酶活性和体外增殖的影响。　方法　以端粒酶RNA模板区为靶点 ,序列为TAGGGTTAGACAA的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸 (ASON )与肾癌细胞株RCZ细胞共同孵育 ,计 1～ 2 8天细胞数 ,MTT比色法测细胞生长抑制率 ,PCR ELISA法检测端粒酶活性。　结果　ASON实验组与随机引物及空白对照组比较 ,端粒酶活性明显降低 (P<0 .0 0 1) ,细胞增殖数目显著减少 (P <0 .0 1) ,抑制率显著增加 (P <0 .0 0 1) ,抑制效果显示剂量依赖性 (P <0 .0 5 ) ,具有序列选择的特异性。　结论　以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸抑制肾癌RCZ细胞的端粒酶活性和体外增殖 ,可能对肿瘤治疗有潜在的意义。     

siRNA靶向沉默B7-H4基因对人前列腺癌DU145细胞增值和凋亡的影响

目的研究siRNA沉默B7-H4基因对人前列腺癌DUl45细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体Lipofeclami-ne“2000（Lipo）为载体转染siRNA-B7-H4至DUl45细胞,应用RT-PCR和WesternBlot检测B7-H4表达水平,CCK-8法检测细胞增殖的变化,Annexinv／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与空白组和阴性对照组（NC）相比,转染B7-H4-siRNA的细胞B7-H4mRNA和蛋白表达明显减少（P〈0．05）,DUl45转染B7-H4siRNA后,增殖能力减弱,凋亡显著。结论通过B7-H4-siRNA抑制DUl45细胞B7-H4的表达,可以抑制细胞增殖,促进其凋亡,表明B7-4在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用。     

RNA干扰对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达的抑制作用

目的 观察特异性小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因表达的抑制作用.方法 脂质体方法将siRNA转染肝癌细胞PLC、Hep3B.定量RT-PCR、Western blot检测MIF mRNA和蛋白、MAPK信号分子的表达.噻唑蓝(MTY)比色法、体外细胞侵袭实验检测细胞增殖和对重组基底膜(matrigel)穿透能力.结果 100 nmol/L的MIF siRNA使MIF mR-NA表达下调81.3%和89.1%,蛋白水平降低69.50%、72.31%,与对照组比较其差异有统计学意义(P均＜0.01).细胞增殖率下降16.79%和47.14%(P均＜0.05).穿透matrigel的细胞数为51.00±11.27和18.56±4.72,与对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05).磷酸化MAPK下调.结论 MIF siRNA有效抑制MIF表达及肝癌细胞增殖和迁移,可能部分通过抑制MAPK磷酸化起作用.