结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析

目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,进行DNA测序、同源性分析,为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础.方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由288bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为90%.结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,测序结果表明该片段阅读框完整.     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的 构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretory antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌BL21菌体中哪诱导表达，并经镍柱纯化、Western—blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白分子量约25kDa，并能与特异性单抗结合，具有一定活性。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretary antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌B121菌体中IPTG诱导表达，并经镍柱纯化、Western．blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白相对分子质量约2．5Xlo＇，并能与特异性单抗结合，具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

基因释放剂制备结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)DNA模板与传统制备方法比较

目的:比较常规试剂盒和使用基因释放剂提取结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)DNA模板的质量,为进一步获得目的基因优化方案.方法:提取结核杆菌DNA阶段,分别使用常规试剂盒和基因释放剂,然后采用相同的PCR方案进行扩增,溴化乙锭染色,紫外光下观察目的基因扩增效果.结果:常规试剂盒提取结核杆菌DNA,未能扩增出相应的目的基因;而使用基因释放剂,则扩增效果良好.结论:常规试剂盒相比,基因释放剂在提取结核杆菌DNA时,能够制备良好的模板,为PCR扩增目的基因奠定基础.     

结核杆菌特异性抗原对结核病诊断价值研究

目的从人血清提取结核杆菌早期分泌性抗原靶6、培养滤液蛋白、结核杆菌分泌蛋白38KD进行标测,探讨结核病诊断新方法。方法选择我院2007年1月～2008年1月间住院肺结核病人和健康查体者,应用结核分枝杆菌相关性抗原ESAT-6、CFP10、38KD检测试剂盒测定血清结核菌抗原水平,同时对所有入选者均行结核菌培养。结果活动性肺结核患者血清中检测到结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP10、38KD的阳性率高,与健康对照组有统计学差异（P〈0．005）;结核分枝杆菌抗原可区分结核感染和非感染,与结核菌素试验比较有显著的统计学差异（P〈0．001）。结论血清结核杆菌特异性抗原能够作为诊断结核病的依据,对鉴别活动性肺结核、非活动性肺结核、非结核病具有重要的价值。     

结核菌早期分泌性靶抗原免疫学研究进展

结核病仍是世界上最严重传染病之一。结核菌早期分泌性靶抗原（ESAT-6）是结核分枝杆菌的一种早期分泌蛋白,它的免疫原性是目前研究热点。本文就ESAT-6在结核菌的致病性,结核病诊断及保护性免疫等方面的研究进展作一综述。     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的:构建E.coli.-BCG(Bacille Calmette-Guerin)穿梭载体，在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌(MTB)的分泌蛋白Ag85B-ESAT-6．方法：用聚合酶链反应(PCR)]从MTB毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌19000抗原(19-ss)胞壁区及其上游调控元件基因，克隆入E.coli.-BCG穿梭载体pOLYG中，构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E.coli.-BCG穿梭载体．用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT-6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达．     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的 制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法 用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果 制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^-5。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论 制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统，建立表达及纯化方法，为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物，从结核菌基因组DNA中扩增基因，酶切后插入表达载体，测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株，经IPTG诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功，纯化出目的蛋白。     

改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较

目的: 建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法。方法: 选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA。同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA。采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果。结果： 以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因。 结论： 改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求。     

重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较

目的 探讨结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)对结核性胸膜炎的辅助诊断价值.方法 分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞(PEMCs),经早期分泌抗原靶6 kD(ESAT-6)、培养滤液蛋白10 kD (CFP-10)、ESAT-6/CFP-10融合蛋白(E/C)...     

外周血基因组DNA提取方法比较

目的建立快速经济有效提取微量外周血基因组DNA的方法。方法采用酚/氯仿提取法、NaCL沉淀法和试剂盒法,直接从人外周血中提取基因组DNA,并以此为模板,进行肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段的扩增及鉴定。结果酚/氯仿法和试剂盒法提取的DNA量大,需血量少,用于PCR扩增结果稳定。结论酚/氯仿提取外周血DNA稳定、高效、经济,可用于批量临床标本的制备。     

改良酚-氯仿法提取及不同试剂盒扩增检测陈旧性人骨DNA

目的：探讨改良酚-氯仿法提取及不同试剂盒扩增对陈旧性人骨DNA检测的效果。方法：用传统和改良的酚-氯仿法对30例陈旧性人骨进行DNA提取,用Identifiler-plus试剂盒、Minifiler试剂盒和GodeneyeTM 20A试剂盒行荧光标记和复合扩增,Genetic Analyzer软件对基因位点进行检测和分析。结果：改良酚-氯仿法提取及3种试剂盒对陈旧性人骨DNA基因位点检出469、262、588个,高于传统法的307、175、436个。结论：改良酚-氯仿法、3种试剂盒PCR复合扩增能对陈旧性人骨DNA进行有效提取和检测。     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。