说明

<正>本刊2010年6月第16卷第3期第341页刊登的孙地武等医生撰写的"芦荟生肌膏精提液对内毒素刺激的成纤维细胞增殖的影响"一文,其通信作者为温州医学院附属第二医院肛肠外科主任     

芦荟生肌膏对大鼠直肠损伤模型的治疗机制

目的:探讨芦荟生肌膏对大鼠直肠损伤模型的治疗机制。方法:健康Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组、模型组、芦荟生肌膏治疗组。连续治疗7d后,取各组大鼠直肠组织行蛋白质含量(考马斯亮蓝法)、髓过氧化物酶、成纤维细胞数及病理组织学检查。结果:芦荟生肌膏治疗组的直肠组织蛋白含量、成纤维细胞数明显高于模型组,而髓过氧化物酶的含量显著低于模型组(P0.01)。芦荟生肌膏治疗组的直肠病理组织学检查上皮基本完整,浆膜层基本正常。结论:芦荟生肌膏对大鼠直肠损伤模型有显著的治疗作用,其机制可能与减轻受损组织的炎性反应、促进成纤维细胞增生等有关。     

冰蜜生肌膏对兔成纤维细胞增殖影响的实验研究

目的:观察冰蜜生肌膏促进体外培养兔成纤维细胞增殖的影响。方法:采用消化分离法进行兔成纤维细胞的原代培养,通过形态学和免疫组织化学的方法鉴定成纤维细胞。第3代纯化的成纤维细胞分为5组,空白对照组每孔加入等量的PBS,实验组每孔分别加入125、62·5、31·25、15·625mg/ml的冰蜜生肌膏提取液进行培养,培养24、48、72h后分别行MTT法检测每孔的光吸收值(OD值)。结果:冰蜜生肌膏提取液加入到成纤维细胞中培养24、48、72h后,经MTT法检测,不同浓度(浓度分别为125、62·5、31·25、15·625mg/ml)冰蜜生肌膏与对照组OD值比较差异有显著性统计学意义(P<0·05)。结论:15·625mg/ml浓度冰蜜生肌膏对成纤维细胞的生长有明显促进作用(P<0·05),药物浓度在15·625~62·5mg/ml时其作用随药物浓度升高而增加,并在浓度为62·5mg/ml时达到最大效应值(P<0·01),当药物浓度大于62·5mg/ml时则作用趋向于饱和,提示一定浓度范围内的冰蜜生肌膏药液能明显增加成纤维细胞数量,且促进作用和浓度呈显著依赖性。     

回阳生肌膏提取物对人慢性皮肤溃疡创缘成纤维细胞体外促增殖研究

目的:观察回阳生肌膏水、醇提取物对人慢性皮肤溃疡创缘成纤维细胞(uHFB)增殖的影响,并探讨其对c-fos、c-myc表达的影响.方法:组织块法培养uHFB;alarmar blue摄入法检测回阳生肌膏水、醇提取物对uHFB的增殖作用;免疫细胞化学方法检测二者对c-fos、c-myc表达的影响.结果:与对照组比,回阳生肌膏醇、水提取物分别在0.027～0.213 mg/L和0.15～1.2 mg/L浓度范围内对uHFB有促增殖作用(P＜0.05或P＜0.01);醇提物组c-fos蛋白在2 h达峰值,水提物组c-fos蛋白在1-3 h内持续增加至醇提物组2 h时水平;水、醇提物组c-myc蛋白在2-3 h内均增加,但醇提物组的表达强度高于水提物组.结论:回阳生肌膏可能通过上调核转录因子表达正向调控修复细胞增殖,加速创面愈合.     

几丁糖对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用

目的:探讨几丁糖对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用。方法:用组织块法进行瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的体外培养;MTT比色法和流式细胞仪检测法分别检测不同浓度几丁糖对不同来源成纤维细胞生长增殖和细胞周期的影响。结果:各组成纤维细胞增殖明显受抑制,几丁糖的浓度和细胞OD值改变之间存在剂量-效应关系,各组成纤维细胞G_0 G_1期的细胞百分比增多,S期G_2 M期的细胞百分比减少,减少率各组无显著差异(P>0.05),S期G_2 M期的细胞百分比减少率有显著差异(P<0.05)。结论:几丁糖对正常皮肤及增生性瘢痕和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞的生长增殖均有抑制作用,有望在瘢痕的防治中发挥重要作用。     

脂多糖对小鼠肺成纤维细胞Thy-1 mRNA表达的影响

目的 评价脂多糖(LPS)对小鼠肺成纤维细胞胸腺细胞分化抗原-1(Thy-1)mRNA表达的影响.方法 原代培养小鼠肺成纤维细胞接种于96孔培养板密度(1×104/ml).培养48 h后,将其分为4组(n=3):PBS对照组(C组)、0.01 μg/ml LPS组(LPS0.01组)、0.10 μg/ml LPS组(LPS0.10组)和1.00μg/ml LPS组(LPS1.00组),分别加入PBS或以上终浓度LPS,在加入后即刻、6、24、48和72 h时(T0-4),分别采用CCK-8细胞计数法检测细胞增殖水平,RT-PCR法检测细胞Thy-1 mRNA表达.结果 与C组相比,T3,4时其余组细胞增殖水平升高,Thy-1 mRNA表达下调(P＜0.05);T3,4时LPS0.01组、LPS0.10组和LPS1.00组细胞增殖水平依次升高,Thy-1 mRNA表达依次下调(P＜0.05).结论 LPS可下调Thy-1 mRNA表达,引起小鼠肺成纤维细胞异常增殖,提示内毒素血症诱发肺纤维化与肺成纤维细胞Thy-1表达下调有关.     

阻断Notch信号的角质形成细胞对成纤维细胞增殖及分泌功能的影响研究

目的:探讨在复合培养的条件下,将阻断Notch信号后的角质形成细胞与成纤维细胞共培养,对成纤维细胞增殖及表达角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF)、TGF-β1的影响。方法:运用角质形成细胞-成纤维细胞复合培养的模型,于复合培养前3d进行血清刺激或者γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断角质形成细胞中的Notch信号,即在角质形成细胞分化前进行干预。然后提升至气液交界面使其达到复层生长和终末分化,后与成纤维细胞共培养,观察阻断Notch信号后的角质形成细胞对成纤维细胞增殖及分泌功能的影响。结果:分化前,给予角质形成细胞血清刺激,复合培养0h,Notch-1、Jagged-1表达明显升高(P0.05);复合培养第1天,P21表达上调、P63表达下降(P0.05)。血清刺激前给予DAPT预处理,复合培养0h,角质形成细胞中Notch信号下游分子P21和P63的表达恢复至无血清刺激水平(P0.05)。DAPT组的成纤维细胞增殖能力、KGF及TGF-β1的表达相对于血清刺激组明显被抑制(P0.05),而与无血清组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:阻断Notch信号后的角质形成细胞与成纤维细胞共培养,能够明显抑制成纤维细胞的增殖及KGF、TGF-β1的合成。     

冰蜜生肌膏对兔成纤维细胞增殖影响的实验研究

目的:观察冰蜜生肌膏促进体外培养兔成纤维细胞增殖的影响。方法:采用消化分离法进行兔成纤维细胞的原代培养,通过形态学和免疫组织化学的方法鉴定成纤维细胞。第3代纯化的成纤维细胞分为5组,空白对照组每孔加入等量的PBS,实验组每孔分别加入125、62·5、31·25、15·625mg/ml的冰蜜生肌膏提取液进行培养,培养24、48、72h后分别行MTT法检测每孔的光吸收值（OD值）。结果:冰蜜生肌膏提取液加入到成纤维细胞中培养24、48、72h后,经MTT法检测,不同浓度（浓度分别为125、62·5、31·25、15·625mg/ml）冰蜜生肌膏与对照组OD值比较差异有显著性统计学意义（P<0·05）。结论:15·625mg/ml浓度冰蜜生肌膏对成纤维细胞的生长有明显促进作用（P<0·05）,药物浓度在15·625⁶2·5mg/ml时其作用随药物浓度升高而增加,并在浓度为62·5mg/ml时达到最大效应值（P<0·01）,当药物浓度大于62·5mg/ml时则作用趋向于饱和,提示一定浓度范围内的冰蜜生肌膏药液能明显增加成纤维细胞数量,且促进作用和浓度呈显著依赖性。     

HU308对脂多糖诱导小胶质细胞分泌NO及IL-6的影响

目的研究大麻素CB2受体激动剂HU308对脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞激活后NO及IL-6分泌的影响。方法体外培养小鼠小胶质细胞株（BV-2细胞）,分为对照组、LPS刺激组及干预组（LPS＋HU308）。通过显微镜观察各组小胶质细胞的形态学变化,CCK-8法检测各组小胶质细胞的增殖情况,Griess法检测各组NO含量,ELISA法检测各组IL-6水平。结果LPS刺激组的小胶质细胞中出现大量胞体增大,伪足粗短或消失的细胞和一些坏死细胞,细胞增殖较差,NO及IL-6表达水平显著增高。经大麻素CB2受体激动剂HU308干预后,大部分细胞胞体稍大,伪足尚明显,细胞破坏程度轻,增殖较好,炎性因子表达均明显下降。结论激动小胶质细胞表面的大麻素CB2受体,可以减轻LPS造成的小胶质细胞过度活化或损伤,抑制其炎性因子N0及IL-6的分泌,从而达到中枢神经系统炎性损伤后的神经保护作用。     

凝血酶对人皮肤成纤维细胞增殖作用的研究

目的：观察不同浓度的凝血酶对成纤维细胞的刺激作用,以及阿加曲班对这种刺激的抑制作用。方法：采用贴壁法进行人皮肤成纤维细胞原代培养,并传代、鉴定。用MTT法检测不同浓度凝血酶刺激后的成纤维细胞活力。用氯胺T法检测不同浓度凝血酶刺激后的细胞上清中羟脯氨酸含量。用免疫组化的方法检测凝血酶刺激后的成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况。在培养液中加入阿加曲班后重复上述检测。结果：①培养的细胞为典型的成纤维细胞形态,波形蛋白单克隆抗体免疫组化染色呈阳性;②加入不同浓度凝血酶的各组吸光值均高于不加凝血酶组（A组）（P〈0.01）,加入阿加曲班和凝血酶的各组吸光值与A组无显著性差异（P〉0.05）;③加入不同浓度凝血酶的各组细胞上清中羟脯氨酸含量均高于不加凝血酶组（A组）（P〈0.01）,加入阿加曲班和凝血酶的各组上清中羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异（P〉0.05）;④凝血酶刺激后的成纤维细胞中有α-SMA的表达,加入阿加曲班后此种表达被抑制。结论：凝血酶能诱导成纤维细胞增殖、胶原分泌量增加,能刺激成纤维细胞表达α-SMA,使成纤维细胞转变为肌成纤维细胞。阿加曲班能抑制凝血酶的这种作用。     

三维培养的人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨三维培养的人皮肤成纤维细胞的生物学特性,为其在皮肤组织工程中的应用提供进一步的实验依据。方法培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原;对人皮肤成纤维细胞进行三维培养,流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡,RTPCR检测TGFβ1、层粘连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA的表达,电镜观察细胞的形态学特征。结果三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,未见明显细胞凋亡。RTPCR检测二维、三维培养的人皮肤成纤维细胞TGFβ1、FnmRNA的表达无明显差异。电镜观察细胞染色质多,细胞器丰富。结论三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,但生物学活性良好。     

内毒素对人正常皮肤成纤维细胞表型变化的影响及意义

目的：研究细菌内毒素（LPS）刺激后的正常皮肤成纤维细胞的表型改变,探讨其与增生性瘢痕形成的关系.方法：体外培养增生性瘢痕患者瘢痕组织和正常皮肤成纤维细胞,正常成纤维细胞分别经不同浓度LPS（0、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/ml）刺激,并对刺激后细胞进行传代,通过病理学、免疫组化染色、电镜观察等方法,观察成纤维细胞表达增殖细胞核抗原（PCNA）、α1（Ⅰ）前胶原蛋白、α平滑肌肌动蛋白的规律及透射电镜下超微结构的变化,并以相同代数的瘢痕组织成纤维细胞作对照.结果：瘢痕组织成纤维细胞光镜下核浆比例大;免疫组织化学染色显示PCNA、α1（I）前胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞比例分别为0.88±0.15、0.42±0.11和0.38±0.13;电镜下显示细胞形态多样化,核膜不规则,胞浆内粗面内质网和高尔基复合体多,伴微丝、微管及肌微丝出现.正常皮肤成纤维细胞PCNA阳性细胞比例为0.37±0.09,未见α1（I）前胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白表达.正常皮肤成纤维细胞经LPS刺激后,随着刺激浓度的增加,光镜下核浆比例逐渐增大;免疫组织化学染色显示PCNA、α1（I）前胶原蛋白阳性细胞和α平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞逐渐增多;电镜下显示细胞形态发生多样化,核浆比例增加,核膜变得不规则,胞浆内粗面内质网和高尔基复合体进一步增多,微丝微管增加,肌微丝出现.上述变化在LPS 0.1ug/ml时最明显[PCNA、α1（I）前胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白阳性细胞比例分别为：0.91±0.15、0.40±0.15和0.44±0.13],接近瘢痕组织成纤维细胞,表明成纤维细胞逐渐向增殖表型、合成型或收缩表型变化.此后,随着LPS浓度继续升高,上述表型标志的表达和细胞形态均趋向于正常成纤维细胞.结论：LPS刺激后皮成纤维细胞表型变化规律,提示LPS可能与增生性瘢痕形成有关.     

瘢痕表皮角蛋白的变化规律及正常表皮细胞培养液对成纤维细胞胶原合成的影响

目的：研究增生性瘢痕和正常皮肤表皮角蛋白的变化规律以及正常表皮细胞培养液对瘢痕和正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法：4例烧伤患者,每人取少量增生性瘢痕和临近的正常皮肤组织,用免疫组化法观察两种组织中与细胞增殖有关的角蛋白14、与细胞分化有关的角蛋白10和与细胞活化有关角蛋白16的变化。收集正常表皮细胞培养12h后的无血清培养液,用DMEM依次配成体积分数为0、5％、10％和20％,分别加入到加有正常和瘢痕组织成纤维细胞的培养板中。分别以MTT法测定吸光度（A）值,Beckman液闪计数仪测定3H-脯氨酸掺人值,分别用以反映成纤维细胞的增殖和胶原合成速率。结果：与正常表皮比较,瘢痕表皮中角蛋白16明显表达增强,角蛋白10降低,角蛋白14无明显变化;正常表皮细胞培养液能促进正常皮肤和瘢痕成纤维细胞的增殖并抑制胶原的合成,但对两种成纤维细胞的作用程度不尽相同,对正常成纤维细胞增殖的促进作用和对胶原合成的抑制作用都较瘢痕成纤维细胞显著。结论：瘢痕表皮的活化可能是瘢痕增生的一个重要因素;正常表皮细胞培养液既能促进成纤维细胞增殖,还能抑制胶原的合成,但对瘢痕成纤维细胞胶原合成的抑制作用较正常成纤维细胞弱。     

生肌化瘀方及其拆方对体外培养创面肉芽组织成纤维细胞周期的影响

目的 :从细胞分裂周期变化角度探讨生肌化瘀方促进创面修复及皮肤修复的机理。 方法 :采用体外培养创面肉芽组织成纤维细胞 ,并用乳鼠皮肤成纤维细胞作对照 ,分别加入用血清药理学方法制备的生肌方、化瘀方、生肌化瘀方大、小剂量药物血清。通过流式细胞仪检测成纤维细胞分裂周期的变化。 结果 :模型组细胞处于S期的比例低于正常组 (P <0 0 5 )。生肌方组细胞处于S期的比例明显高于正常组 (P <0 0 1)。化瘀方组细胞处于S期的比例明显低于正常组 (P <0 0 5 )。生肌化瘀方各剂量组细胞处于S期的比例均与正常组相比差异无显著性 (P >0 0 5 )。 结论 :生肌化瘀方通过调控创面肉芽组织成纤维细胞增殖周期的影响 ,使创面修复达到皮肤修复。     

光老化作用对体外人皮肤成纤维细胞的影响

目的 建立体外分离培养人皮肤成纤维细胞的光老化模型,观察研究中波紫外线对人皮肤成性纤维细胞的影响.方法 使用组织块法分离培养原代人皮肤成纤维细胞,并用免疫荧光特异性标记物鉴定证实,选择不同剂量的紫外线照射人皮肤成纤维细胞后,倒置显微镜观察细胞形态学的改变;β-半乳糖苷酶(β-gal)细胞衰老试剂盒染色;MTT检测不同剂量的紫外线照射对成纤维细胞增殖能力影响;western blot检测衰老标志物P16蛋白的表达.结果 组织块法成功分离获得人皮肤成纤维细胞,用20～60mJ/cm2 UVB单次照射后,可以成功诱导人皮肤成纤维细胞出现衰老形态学的改变,其增殖能力降至正常对照组的一半左右,β-gal染色阳性率约90%,衰老相关蛋白P16表达随时相明显升高.结论 20～60mJ/cm2中波紫外线照射人皮肤成纤维细胞可诱导人皮肤成纤维细胞衰老,为今后皮肤光老化的体外研究提供了参考.     

脂多糖刺激后人正常皮肤成纤维细胞基因表达谱的变化及其意义

目的：观察正常皮肤成纤维细胞经大肠杆菌内毒素（LPS）刺激后基因表达谱的变化,探讨LPS对后期瘢痕形成的影响及可能机制.方法：用0.1 μg/ml LPS刺激正常皮肤成纤维细胞并进行连续传代培养,选择第3代成纤维细胞,采用基因芯片技术检测成纤维细胞基因表达谱的变化,与自身正常皮肤成纤维细胞及自身增生性瘢痕组织成纤维细胞相关基因进行对比,挑选差异基因,采用逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行验证.结果：LPS刺激后正常皮肤成纤维细胞基因表达谱发生改变,其中与胶原代谢相关的基因（Ⅰ型胶原、c-myc、TGF-β1mRNA）表达均上调;RT-PCR结果显示,这些基因表达与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞表达量近似（P〉0.05）.结论：LPS可能诱导正常皮肤成纤维细胞转化为增生性瘢痕组织成纤维细胞,参与增生性瘢痕形成.     

通络保肾复方对LPS刺激的肾小球足细胞增殖及其nephrin表达的影响

目的:探讨通络保肾复方对肾小球足细胞增殖及肾小球足细胞表达nephrin的影响。方法:将5%含药血清培养基加入体外培养的肾小球足细胞,分别于脂多糖(LPS)刺激肾小球足细胞12 h、24 h、36 h、48 h后,MTT方法检测各组肾小球足细胞的增殖情况,以及Western-blot方法检测LPS刺激36 h时肾小球足细胞nephrin的表达。结果:LPS刺激12 h后肾小球足细胞开始增殖,36 h达到高峰,48 h后开始下降。通络保肾复方能够抑制肾小球足细胞的增殖,其中以通络保肾复方大剂量组效果显著,与LPS组比较差异有统计学意义(P0.05)。同时通络保肾复方可以上调36 h时由LPS刺激导致的肾小球足细胞nephrin的表达。结论:本研究结果提示,通络保肾复方可以抑制LPS诱导的肾小球足细胞的增殖,上调肾小球足细胞nephrin的表达,减少足细胞的损伤,降低蛋白尿的发生,从而延缓糖尿病肾病的进一步发展。     

神经再生条件液对成纤维细胞和施旺细胞的生物学活性影响

目的探索神经再生条件液对体外培养的大鼠成纤维细胞和施旺细胞的生物学活性影响。方法用含有不同浓度的NRCF的培养基连续培养成纤维细胞和施旺细胞24h，用CCK-8法检测细胞增殖；用流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测施旺细胞去分化。结果随着神经再生条件液浓度的提高及神经再生条件液对细胞作用时间的增加，成纤维细胞和施旺细胞的增殖呈上升趋势；神经再生条件液对成纤维细胞和施旺细胞的细胞周期改变发生在S期；神经再生条件液能够促进施旺细胞去分化。结论神经再生条件液能够促进成纤维细胞的增殖并促进施旺细胞的增殖和去分化。     

声动力疗法对人增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用的实验研究

目的观察华卟啉钠声动力治疗(DVDMS-SDT)效应对人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用。方法将人增生性瘢痕成纤维细胞悬液分为四组,分别采用MTT法检测人增生性瘢痕成纤维细胞存活率。经流式细胞仪检测,罗丹明123检测线粒体跨膜电位,二氯荧光黄双乙酸盐检测细胞内活性氧,乙酰甲酯衍生物检测细胞内钙离子浓度的变化,33258核染色观察细胞核的形态改变。结果 MTT检测法显示DVDMS-SDT组细胞存活率与其他组间同一时间段比较,差异有统计学意义(P0.01)。经流式细胞仪检测,线粒体膜电位降低的细胞百分比、细胞内活性氧增高和细胞内钙离子增高的细胞百分比,SDT组与其他组相比,差异有统计学意义(P0.01)。33258细胞核染色显示坏死与凋亡、细胞核浓缩和絮状改变、核边集。结论 DVDMS-SDT能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性,增殖活性受抑制可能与细胞内活性氧和细胞内钙离子浓度增高、膜损伤有关。     

苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的抑制作用实验研究

目的:研究苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其相关作用机制。方法:通过收集手术切除的瘢痕疙瘩进行体外培养成纤维细胞,将细胞分为3组,分别加入10μmol/L,20μmol/L的苦参碱以及对照组(0.9%NaCl)进行实验。MTT实验检测细胞增殖情况;流式细胞技术进行细胞周期分析;Hoechest33258染色检测细胞凋亡情况;Westernblot实验检测苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡和自噬相关调控蛋白表达的影响。结果:通过不同浓度的苦参碱处理细胞后,MTT结果发现成纤维细胞的增殖受到抑制,抑制作用具有剂量依赖性;细胞周期分析发现,苦参碱作用后细胞的G1-S期转化受到了不同程度的抑制;Hoechest 33258染色发现苦参碱可以促进凋亡细胞的增加;Western blot实验结果发现苦参碱可以抑制CDK4、CDK6、Bcl-2和LC3-I蛋白的表达,促进Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达。结论:苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用,能够影响细胞增殖、凋亡和自噬相关调控蛋白的表达。