组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定

背景:组织块培养法分离人脂肪源性干细胞并进行体外培养,培养体系简单,节约时间,较好地保持了干细胞的生物学特性,并据此向多方向诱导分化,为组织工程学种子细胞的临床应用提供理论依据和参考路线。目的:观察组织块培养法分离的人脂肪源性干细胞的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化潜能。方法:取健康人腹部皮下脂肪组织,组织块培养法分离出脂肪源性干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。流式细胞仪检测第 3 代脂肪干细胞的细胞周期及表面抗原。取第 3 代人脂肪干细胞,分别用成骨和成脂诱导培养液诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,Von Kossa 染色、油红 O 染色定性鉴定。结果与结论:原代及传代的人脂肪干细胞形态均类似成纤维细胞,生长能力旺盛。第 3 代人脂肪干细胞中,超过 88%的细胞都处于 G0/G1期。第 3 代脂肪干细胞表面抗原表达:CD29、CD44、CD90、CD105 表达阳性,CD34、CD45、CD106表达阴性。人脂肪干细胞经成脂诱导后 21 d,油红 O 染色阳性;成骨诱导培养后,茜素红染色和 Von Kossa 染色阳性。因此,实验证实人脂肪源性干细胞能向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化。     

差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从大鼠腹股沟脂肪垫分离纯化脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的可行性。方法:采用差速贴壁培养法分离ADMSCs,并与普通培养法得到的ADMSCs进行表面分子CD44阳性率对比。在第2代ADMSCs中加入条件培养基进行诱导,根据条件培养基的不同分成3组:①成骨诱导组:加入成骨培养基;②成脂诱导组:加入成脂培养基;③对照组:仅加入基础培养基。成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶(ALP)检测,成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测。结果:差速贴壁培养法获得CD44阳性率更高的ADMSCs。成骨诱导组的ALP大大高于对照组,成脂诱导组油红O染色阳性,对照组油红O染色均为阴性。结论:差速贴壁培养法从大鼠腹股沟脂肪垫中分离得到高纯度ADMSCs。     

悬浮组织块法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞的实验研究

目的:建立SD 大鼠脂肪干细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常SD 大鼠股沟处脂肪组织,用悬浮组织块法和组织块贴壁法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞,观察细胞的生长状况及形态特征。取第3 代对数期细胞,CCK-8 法绘制其生长曲线;免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD45 的表达情况;分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果:两种方法体外培养得到的SD 大鼠脂肪干细胞形态为梭形纤维样,生长力旺盛,生长曲线为典型的“S冶型;免疫荧光法检测显示第3 代细胞强表达CD29、CD44,CD45 表达阴性;细胞成脂诱导培养14 d 后,油红O 染色为阳性;成骨诱导培养14 d 后,茜素红染色为阳性。结论:悬浮组织块法可以分离培养出SD 大鼠脂肪干细胞,方法简便,为体外分离培养SD 大鼠脂肪干细胞提供了一种新的方法。     

组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景：体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础。 目的：采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。 方法：无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10~15 min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1 mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3 d换液1次,当细胞长到80%~90%融合时按1∶3传代。 结果与结论：一般10 d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样。传代细胞刚接种时圆形,4~6 h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群。从传代细胞的生长曲线可看出,前4 d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7 d以后进入平台期。免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性。结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞。     

体外扩增的自体脂肪干细胞介导自体脂肪移植的临床研究

目的探讨并评估体外扩增的自体脂肪干细胞介导自体脂肪移植的治疗效果。
　　方法实验组50例患者经过自体脂肪干细胞分离、培养、体外扩增后,介导自体脂肪颗粒注射移植,充填面部塑形、隆胸,随访6~24个月。手术分为两期,第一期：取患者自体脂肪颗粒细胞15~20 ml,进行体外分离、培养、扩增,扩增至第3代,进行细胞免疫表型、分化潜能、遗传稳定性鉴定。第二期：20~25 d 后,抽取一定量的患者自体脂肪颗粒混合第5~6代自体脂肪干细胞移植,用于鼻部、颏部、额部及颞部等面部充填塑形和隆胸。对照组10例患者,单纯自体脂肪移植。
　　结果第3~6代自体脂肪干细胞具有典型的间充质干细胞特征,并保持了遗传稳定性。脂肪移植6~24个月后,回访无明显脂肪吸收现象,塑形效果良好。
　　结论自体脂肪干细胞介导的自体脂肪移植术具有微创、移植脂肪成活率高、成形效果好等优点,是具有发展前途的、值得推荐的再生医学技术。     

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景：酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。 目的：比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。 方法：取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。 结果与结论：牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较

BACKGROUND:At present, various methods of extracting cardiac stem cells have been reported in China, but the processes of isolation, culture and purification are not yet standardized. OBJECTIVE: To explore the difference in the culture of rat cardiac stem cells using enzyme digestion method and tissue block method. METHODS:Cardiac stem cells from Sprague-Dawley rats, clean grade, 1 day of age, were extracted and cultured in vitro using the enzyme digestion method (control group) or tissue block method (experimental group). RESULTS AND CONCLUSION: Both of the two methods could produce cardiac stem cells, but the proportion of cultured cells in the experimental group was significantly higher than that in the control group, indicating the tissue block method is superior to the enzyme digestion method in the culture of cardiac stem cells.     

改良组织块培养法体外培养人角膜上皮干细胞

文题释义：角膜上皮干细胞：属于单能干细胞,具有细胞周期长、低分化状态、增殖潜力大、不对称分裂等特点,定位于角膜缘基底细胞层,又称之为角膜缘干细胞,对角膜上皮细胞更新及维持角膜透明起着重要作用。角膜缘干细胞的体外培养方法：主要包括酶消化培养法和组织块培养法。酶消化培养法是利用DispaseⅡ酶破坏角膜缘上皮细胞与基底膜之间的半桥粒连接,然后剥取角膜缘上皮层,再使用胰酶将其消化为单个细胞进行培养。组织块培养法没有经过酶的双重消化,将剖取的角膜缘组织块进行贴壁,细胞游离出组织块进行贴壁生长,需要一个漫长的过程。  摘要背景：角膜上皮干细胞定位于角膜缘,又称之为角膜缘干细胞,临床上由于眼表严重热烧伤、化学性烧伤、慢性炎症等原因引起的角膜缘干细胞缺乏或功能障碍治疗较为棘手。目前利用组织工程技术体外培养角膜上皮干细胞并进行临床移植成为新型有效的治疗方向。目的：探讨在无血清培养条件下采用改良组织块培养法培养人角膜上皮干细胞的可行性。方法：人角膜缘组织来自河南省眼库,植片直径小于8 mm角膜移植术后的供者剩余眼球材料,手术显微镜下剖取角膜缘上皮层外2/3区域,采用2种方法培养人角膜上皮干细胞,常规组织块培养组是将组织块上皮面向上贴壁,加入K-SFM培养液后置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养;改良组织块培养组是先将组织块浸泡于K-SFM培养液中,置于细胞培养箱中孵育12 h,然后组织块上皮面向下贴壁培养。组织块周边有细胞游离出贴壁生长记作“培养第1天”,每日相差显微镜下观察细胞生长变化。利用免疫荧光染色技术检测改良组织块培养第5,10,14天时原代细胞中p63及K3的表达。结果与结论：①改良组织块培养组出膜时间明显短于常规组织块培养组(P < 0.05),出膜率明显高于常规组织块培养组(P < 0.05);②改良组织块培养组细胞生长状态良好,培养第10天可见小体积细胞较多,聚集成灶状分布;培养第14天可见细胞克隆灶,克隆灶内细胞体积较小,形态均一;③培养第5天,K3表达量较多,p63表达量较少;培养第10天,K3和p63表达量均增多;培养第14天,K3表达量未见明显增多,p63表达量明显增多;④在无血清培养条件下,改良组织块培养法能显著促进角膜上皮干细胞的游离,提高体外培养细胞数量,为人角膜缘上皮组织片的构建提供种子细胞。ORCID: 0000-0001-8370-174X(许中中) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

用组织块法培养成年和老年鼠神经干细胞

目的　探索体外培养扩增成年及老年动物室管膜下区 (SVZ)神经干细胞的实用方法。方法　取 8、14及 2 4三个月龄SD大鼠SVZ组织块置含bFGF的DMEM/F12 +B2 7培养液培养 ,Nestin免疫组化法鉴定细胞表型。结果　各月龄的SVZ组织块均能长出Nestin阳性的神经小球及神经干细胞 ,培养 7～ 10天产生的神经球最多 ,神经干细胞状态最佳。结论　用含bFGF的培养基培养成年和老年大鼠SVZ组织块能产生较多的神经干细胞 ;此法是一种具有实用价值的培养、扩增神经干细胞的手段。     

用组织块法培养成年、老年鼠神经干细胞

体外组织块培养成年、老年哺乳动物室管膜下区 ( SVZ)神经干细胞的研究甚少。本研究的目的是探索体外培养神经干细胞的实用方法及扩充神经干细胞作为移植或基因转移的供体细胞来源。取 8、1 4及 2 4月龄 SD大鼠 (雌雄不拘 ) SVZ组织块作体外培养 ,在 DMEM/F1 2 B2 7培养液中加入 b FGF( 2 0 ng/ml) ,促进其组织块形成神经小球 ,刺激神经干细胞增殖 ,并用 Nestin免疫组化鉴定。结果显示 ,培养 7～ 1 0 d产生的神经小球数量多 ,细胞生长状态佳 ,绝大多数细胞为 Nestin阳性的神经干细胞 ,此期的神经干细胞较适宜于作细胞移植或基因转…     

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景：研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。 目的：比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。 方法：体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。 结果与结论：两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染...     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。 目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。 方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von Kossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。 结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的:建立兔成纤维样滑膜细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常兔膝关节滑膜组织,用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞,观察细胞生长状况及形态特征,取第3 代对数期细胞,CCK鄄8 法绘制其生长曲线,免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况,并与组织块贴壁法进行比较。结果:两种方法体外培养得到的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的“S冶形,免疫荧光检测显示第3 代细胞强表达波形蛋白。结论:悬浮组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,效率高,为体外分离培养兔成纤维样滑膜细胞提供了一种新的方法。     

采用康宁HYPERFlask~细胞培养瓶快速扩增人体脂肪干细胞

<正>人脂肪干细胞(h SCs)是一种丰富、易得的多能成体干细胞[1]。尽管我们可获取大量吸脂术后的脂肪,但是细胞治疗所需的大量未分化存活细胞仍需要通过高效的体外扩增方法才能得到。例如,在一项旨在改善肌肉萎缩症,并以小鼠为模型的治疗实验中,我们在每月一次注射106个细胞时得到了阳性结果[2]。如果我们将其应用于人体,一个体重60 kg的人每月大约需要3×109个干细胞。我们试验     

脂肪干细胞在软骨组织工程中的应用

软骨是最早应用组织工程技术成功构建的组织之一,但由于缺乏合适的软骨构建种子细胞,因此其发展相对落后。随着干细胞研究的兴起,脂肪干细胞（ASC）因其具有分布广泛、可利用细胞量大、取材容易等优点,为ASC作为种子细胞应用于组织工程研究提供了可能;但是ASC构建软骨组织的效果却不如骨髓间充质干细胞（BMSC）理想。因此ASC在软骨组织工程中的应用仍面临着诸多问题与挑战,其中最核心的问题是如何提高ASC成软骨的效率。为此从如何纯化脂肪来源细胞、尽可能保持其中干细胞的生物学特性并优化软骨诱导方案3个方面予以综述,为提高ASC成软骨的效率提供参考。     

脂肪干细胞在软骨组织工程中的研究进展

近年来脂肪干细胞（ADSC）的成软骨潜能备受瞩目,其作为种子细胞在软骨组织工程应用方面前景广阔,然而目前并没有一种高效的诱导方法被世界公认。外源性生长因子、基因修饰、共培养、生长因子与共培养联合、支架材料等多种手段均可诱导ADSC向软骨细胞方向分化,但各方法的优劣,诱导分化时的信号通路及新生软骨的性状并未见详细的分析和讨论。文中介绍了以上多种诱导方法的研究现状及问题,并讨论了化学因素、供体年龄、组织获取部位等对其的影响,以期为ADSC的临床应用提供一定的理论参考。     

原代大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养扩增及鉴定

背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用。目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索。目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体。方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO₂培养箱内进行原代培养。待细胞达80%-90%融合时,以1∶3的比例进行传代培养。倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验。结果与结论:(1)原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80%-90%,呈漩涡状排列;...     

改良植块贴壁法建立大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型

目的：建立大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型。 方法： 参照传统的主动脉平滑肌细胞培养方法，在动物体重、中膜的取材、植块贴壁过程、培养基选择、细胞传代等多个关键环节进行改进，成功建立了大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型；用倒置相差显微镜对培养细胞进行形态学观察，用特异性α-SM-actin单克隆抗体免疫组织化学对培养细胞进行鉴定。 结果： 台盼蓝检查传代细胞的存活率大于96%；培养细胞排列呈梭形及“峰”“谷”状的结构特征；免疫组织化学染色鉴定培养细胞中的平滑肌细胞的纯度为97%。 结论： 此培养方法可作为研究血管平滑肌细胞生物学行为和移植血管再狭窄机制的有效模型。     

对比组织悬液法及组织块法建立兔VX2皮下肿瘤模型的差异

文题释义：彩色多普勒血流显像(Color Doppler Flow Imaging，CDFI)：是利用红细胞与超声波之间的多普勒原理进行血流显像的技术，根据血流的方向和速度大小，进行伪彩色编码，后经彩色显示器显示，从而完成彩色多普勒血流显像。 VX2肿瘤(VX2 Tumor)：来源于Shope病毒，属于鳞状细胞癌的一种，可使乳头瘤恶变成鳞状上皮细胞癌的恶性肿瘤。因具有与人类肿瘤相似的形态学及生物学特性，目前主要用于动物模型的实验研究，尤其是兔VX2各组织器官肿瘤的影像学及肿瘤治疗的动物模型研究。背景：目前建立VX2皮下肿瘤模型的方法有多种，但建模方法各有优劣，能优质高效建立动物肿瘤模型的方法方可满足动物肿瘤实验的需求。 目的：对比观察不同方法建立兔VX2皮下肿瘤模型，探索更简单高效的建模方式，为兔VX2皮下肿瘤实验提供大批量高质量的动物模型奠定基础。方法：雄性新西兰大白兔66只。取2只制备VX2荷瘤种兔，再取荷瘤兔肿瘤组织分别制备瘤组织块及肿瘤组织悬液备用。实验分为2组：瘤组织悬液组20只，麻醉后于双侧后肢内侧面注射组织悬液0.15 mL；瘤组织块组20只，麻醉后于双侧后肢内侧面皮下植入瘤组织块。2组分别采用相应接种方式种植2只荷瘤种兔，各传5代。记录并比较2组肿瘤种植时间，采用二维及彩色多普勒超声观察肿瘤形态大小及生长情况，比较2组肿瘤成瘤率及传代情况。实验方案经中国人民解放军第三军医大学动物实验伦理委员会批准(批准号为AMUWE2020016)。 结果与结论：①组织悬液法肿瘤种植时间(75.70±11.16) s较组织块法肿瘤种植时间(100.80±9.21) s明显缩短(P=0.00)；②组织悬液法成瘤率95%显著高于组织块法成瘤率60%(P < 0.05)，肿瘤体积显著大于组织块法(P < 0.05)；③组织悬液法传代成功率95%显著高于组织块法传代成功率65%(P < 0.05)；④结果说明，组织悬液法建立兔VX2皮下肿瘤模型与瘤块法相比，更简单高效。 ORCID: 0000-0002-1281-4437(刘娅) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程