骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响

背景：长链非编码RNA调控一系列生理过程,被认为在发育、分化和代谢的基因调控中发挥重要的作用。MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞可向骨细胞、肌细胞等多个方向分化,用于肌肉骨骼等运动系统相关疾病的研究。 目的：观察长链非编码RNA在骨形态发生蛋白2诱导成骨分化中的作用。 方法：对MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下,成骨分化过程中的长链非编码RNA表达变化进行芯片分析,找到在3株细胞中同时变化的长链非编码RNA,siRNA干扰方法观察长链非编码RNA对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响,采用Real-Time PCR与碱性磷酸酶染色检测成骨相关指标。 结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2成骨分化过程中,相应成骨指标增高,成肌指标肌细胞生成素降低。筛选出骨形态发生蛋白2诱导成骨分化过程中出发挥作用的长链非编码RNA AK007000。AK007000被干扰后成骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7表达下降,肌细胞生成素表达上升。因此,AK007000可能具有促进成骨抑制成肌作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中长链非编码RNA的作用

背景：人类长链非编码RNA是现今的研究热点,已有研究报道其在肿瘤发生中的作用机制,但其在成骨分化方面的机制并不明确。 目的：观察人类长链非编码RNA在经骨形态发生蛋白2诱导小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用,并探讨其分子机制。 方法：首先进行碱性磷酸酶染色和成骨指标基因检测。对C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下的成骨分化过程长链非编码RNA表达变化进行芯片分析。采用高通量测序比较骨形态发生蛋白2诱导组和未经骨形态发生蛋白2诱导组的表达变化,筛选出表达下降的基因。过表达相应长链非编码RNA后观察对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响。 结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞导致碱性磷酸酶活性增加。骨形态发生蛋白2诱导72 h后,碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达上升(P < 0.05)。未诱导C3H10T1/2细胞与骨形态发生蛋白2诱导细胞芯片杂交后结果比较,下降达1.5倍的长链非编码RNAs有24条,其中只有AK035085有内含子。与未过表达AK035085的对照组相比,骨形态发生蛋白2诱导72 h后AK035085过表达的C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达均下降(P < 0.05)。提示骨形态发生蛋白2可刺激C3H10T1/2细胞发生成骨分化,AK035085可能对C3H10T1/2细胞的成骨分化存在抑制作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

miR-210-3p通过自噬调控MC3T3-E1细胞成骨分化的机制研究

目的:探讨微小RNA-210-3p(microRNA-210-3p, miR-210-3p)通过自噬对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化的影响。方法:(1)采用脂质体转染法构建miR-210-3p过表达或沉默的MC3T3-E1细胞模型,设置阴性对照(negative control, NC) mimic组、miR-210-3p mimic组、NC inhibitor组和miR-210-3p inhibitor组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标及自噬相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(2)用雷帕霉素(rapamycin, RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)分别构建自噬激活和抑制模型,设置control组、RAPA组和3-MA组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测自噬激活或抑制后MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(3)设置NC mimic组、NC mimic+RAPA组和miR-210-3p mimic+R...     

锌指蛋白3调节骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2是参与骨骼生长发育和修复的重要因子,近年来的研究发现锌指蛋白3参与调节转化生长因子β信号的转导,该研究以此为基础开展研究。目的：探讨抑制锌指蛋白3对骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。方法：以小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2细胞为研究对象,设置绿色荧光蛋白、骨形态发生蛋白2、锌指蛋白3、骨形态发生蛋白2+锌指蛋白3重组腺病毒转染组,增强骨形态发生蛋白2表达,抑制锌指蛋白3表达。采用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶的表达;RT-qPCR检测骨形态发生蛋白2、锌指蛋白3及成骨、成血管标志物mRNA转录水平;免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子及内皮黏蛋白表达水平;茜素红染色及半定量分析检测钙盐沉积水平;裸鼠皮下成骨实验检测异位骨块形成情况。结果与结论：(1)骨形态发生蛋白2重组腺病毒能诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化,与骨形态发生蛋白重组腺病毒组比较,骨形态发生蛋白2+锌指蛋白3重组腺病毒组成骨标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Runt相关转录因子2及成血管标志物神经轴突导向因子、血管内皮生长因子、血管性血...     

转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化

背景:生长因子是骨组织形成、改建、修复的关键要素之一,多种生长因子联合诱导骨干细胞成骨分化相较于单一生长因子具有一定的优势,但是何种类型的联合、什么样的浓度组合才能发挥最佳的诱导作用?目前该方向研究较少.目的:探索转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导对小鼠MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响.方法:将不同质量浓度的转化...     

Atf7ip是骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成体细胞成骨分化的负调节因子

背景：Atf7ip是否参与成骨分化的调控尚未明确,研究其对成骨分化的影响及具体机制具有重要意义。目的：探讨Atf7ip对骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化的影响。方法：将体外培养的MC3T3-E1细胞分为正常组、干扰组(NC-si RNA组、Atf7ip-si RNA组)、高表达组(CMV-VC组、CMV-Atf7ip组),转染处理24 h,然后使用200 ng/mL骨形态发生蛋白2分别处理0,12,24,48 h,qRT-PCR检测各组细胞中Atf7ip、碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达水平,Western blot检测成骨分化标记分子Sp7、Runx2的蛋白表达以及Atf7ip结合分子SETDB1、组蛋白H3、H3K9me3甲基化的表达,并进行碱性磷酸酶活性分析。结果与结论：(1)随骨形态发生蛋白2处理时间增加,Atf7ip的蛋白及mRNA表达减少,而Sp7、Runx2的蛋白表达和骨钙素、碱性磷酸酶的mRNA表达显著增加(P <0.05);Atf7ip结合分子SETDB1的蛋白表达并无明显改变;(2)与NC-siRNA组比较,...     

MC3T3-E1细胞成骨模型的应用及研究进展

骨形成与骨重建涉及各种细胞的协同作用。通过各种体外培养模型,在了解成骨过程的生物学方面取得了显著进展。当前,骨组织工程研究火热,但由于原代人成骨细胞十分有限,这些细胞模型越来越多地被应用。MC3T3-E1细胞是前骨细胞,该细胞在研究骨骼疾病和骨缺损的细胞治疗及组织工程方面具有较大潜力。本文全面回顾了MC3T3-E1细胞成骨模型的培养、鉴定及应用等方面内容。此外,还进一步讨论了该模型的优缺点并提出了几点展望。     

低强度脉冲超声波联合骨形态发生蛋白2促进人牙周膜细胞的成骨分化

背景：低强度脉冲超声波和骨形态发生蛋白2均可促进人牙周膜细胞成骨分化,但两者联合应用尚未见报道。目的：验证低强度脉冲超声波和骨形态发生蛋白2联合应用诱导牙周膜细胞成骨分化的生物学效应。方法：体外分离、原代、传代培养与鉴定牙周膜细胞。取生长良好的第4代牙周膜细胞接种至六孔板中,实验分为4组：对照组、低强度脉冲超声波诱导组、骨形态发生蛋白2诱导组、低强度脉冲超声波联合骨形态发生蛋白2诱导组。采用碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测牙周膜细胞成骨相关基因Ⅰ型胶原、骨桥蛋白的表达。结果与结论：通过低强度脉冲超声波、骨形态发生蛋白2和低强度脉冲超声波+骨形态发生蛋白2诱导后,体外培养的牙周膜细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P < 0.05),其中低强度脉冲超声波+骨形态发生蛋白2组碱性磷酸酶活性最强(P < 0.05)。RT-PCR结果分析显示,低强度脉冲超声波与骨形态发生蛋白2都可以上调Ⅰ型胶原、骨桥蛋白基因的表达(P < 0.01),两者联合处理作用更为明显(P < 0.001)。结果初步提示,低强度脉冲超声波和骨形态发生蛋白2均可以增强牙周膜细胞成骨能力,两者联合应用其成骨诱导能力更强。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Runx2通过抑制细胞巨自噬以诱导C2C12细胞向成骨细胞分化

 目的：探讨细胞巨自噬与Runx2诱导C2C12细胞成骨分化的关系。方法： 在强力霉素(doxycycline, Dox)诱导Runx2表达的细胞系C2C12/Runx2Dox中进行研究。Dox (10 mg/L) 处理0 d、1 d、3 d及6 d后,real-time qPCR检测LC3b、Beclin-1、p62和LAMP-2表达情况,Western blotting分析LC3-I/LC3-II比值。设置不同的3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)或雷帕霉素(rapamycin, Rap)浓度,Dox处理14 d后分析碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。用3-MA (5 mmol/L)或Rap (10 μmol/L)与Dox共同处理1 d、3 d及6 d后检测ALP及骨钙素 (osteocalcin,OC)表达情况。结果： (1) C2C12细胞向成骨分化时,LC3b 与Beclin-1显著下调,p62与LAMP-2无明显变化;(2) LC3-I向LC3-II转换的过程被抑制;(3) 3-MA (5 mmol/L)可增强ALP 活性,而Rap(10 μmol/L)则抑制其活性;(4) 3-MA可上调ALP及OC表达,Rap则下调二者表达。结论： Runx2通过下调LC3和Beclin-1、抑制LC3-I向LC3-II转换的方式阻碍自噬体形成,以诱导C2C12细胞分化为成骨细胞。     

骨形态发生蛋白9体外诱导牙囊细胞的成骨分化

背景：有研究表明骨形态发生蛋白9能促进多种干细胞的成骨分化,但其是否具有诱导牙囊细胞成骨向分化的能力尚不清楚。目的：探讨骨形态发生蛋白9对大鼠牙囊细胞成骨分化的诱导作用。方法：以纯化的第3代大鼠牙囊细胞为研究对象,感染骨形态发生蛋白9腺病毒后,检测牙囊细胞中碱性磷酸酶活性、钙盐沉积以及矿化相关因子基因和蛋白的表达变化。结果与结论：感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞碱性磷酸酶活性持续增强,钙盐沉积明显增强。Real time PCR检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中矿化相关因子碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白和核心结合因子mRNA表达增强。Western blot检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中骨桥蛋白的表达增强。以上结果表明骨形态发生蛋白9可诱导牙囊细胞向成骨方向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化

背景：目前临床对于慢性腱病缺乏有效的治疗手段,原因在于其发病机制至今尚未阐明。 目的：研究体外骨形态发生蛋白2对胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型髌腱来源肌腱干细胞的成骨、成软骨分化的作用。 方法：从大鼠慢性腱病模型的髌腱中分离培养出原代肌腱干细胞,传代培养至第3代细胞,行成骨、成脂、成软骨诱导分化鉴定其干细胞的特性。将肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合,用重组人骨形态发生蛋白2干预。7 d后分别行茜素红染色,并行茜素红染色定量分析。将肌腱干细胞体外三维微球培养后分为2组,诱导组用重组人骨形态发生蛋白2干预,对照组不进行干预。21 d后三维微球行苏木精-伊红染色,阿利辛蓝染色以及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 结果与结论：慢性腱病大鼠来源原代肌腱干细胞体外培养呈克隆样集落生长,传代后细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞,具有成纤维细胞样的特征。肌腱干细胞(P3)成脂诱导10 d,油红O染色阳性;成骨诱导7 d,茜素红染色阳性;成软骨诱导14 d,苏木精-伊红染色阳性可见软骨样细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。单层培养的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2诱导7 d茜素红染色阳性,对照组为阴性,茜素红染色定量检测显示差异有显著性意义。重组人骨形态发生蛋白2诱导肌腱干细胞21 d,苏木精-伊红染色可见软骨样细胞形成、阿利辛蓝染色可见细胞内糖胺多糖沉积、Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。可见体外重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病来源的肌腱干细胞成骨、成软骨分化。这为进一步研究慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

High glucose promotes apoptosis and autophagy of MC3T3-E1 osteoblasts

IntroductionDiabetes and osteoporosis are common metabolic diseases. Abnormal high glucose can lead to the apoptosis of osteoblasts. Autophagy is a highly conserved cellular process that degrades proteins or organelles. In the present study, we comparatively analyzed the effects of high glucose and glucose fluctuation on apoptosis and autophagy of MC3T3-E1 osteoblasts.Material and methodsMC3T3-E1 cells were respectively treated with different concentrations of D-glucose: 5.5 mM for the control group, 25 mM for the high glucose group and 5.5/25 mM for the glucose fluctuation group.ResultsHigh glucose and glucose fluctuation decreased MC3T3-E1 proliferation and activated autophagy. Also, high glucose and glucose fluctuation might induce the production of reactive oxygen species, decline the mitochondrial membrane potential and trigger apoptosis. The differences in the glucose fluctuation treatment group were more significant. Moreover, N-acetylcysteine, an antioxidant reagent, dramatically eliminated the intracellular reactive oxygen species induced by high glucose and glucose fluctuation, and significantly inhibited the autophagy and apoptosis in MC3T3-E1 osteoblasts. Furthermore, treatment with chloroquine, an inhibitor of autophagy, significantly increased the apoptosis of MC3T3-E1 osteoblasts.ConclusionsHigh glucose, especially high glucose fluctuation, inhibits proliferation and promotes apoptosis and autophagy of MC3T3-E1 osteoblasts. This may occur through inducing oxidative stress and mitochondrial damage in the osteoblasts.     

mTORC1 信号促进前成骨细胞MC3T3-E1 的分化成熟

目的:研究mTORC1 信号对前成骨细胞MC3T3-E1 向成骨细胞分化成熟的调控作用。方法:通过向MC3T3-E1 转染pcDNA3.1-Raptor,对mTORC1 信号相关蛋白Raptor 进行过表达。向MC3T3-E1 转染Raptor siRNA,对mTORC1 信号蛋白Raptor 进行基因沉默。通过Real-time PCR 方法测定Raptor 的基因表达,通过蛋白免疫印迹法测定Raptor 蛋白水平,并通过茜素红染色检测成骨矿化情况,以测定成骨分化程度。通过Real-time PCR 检测成骨分化指标的基因表达。结果:与对照组相比,Raptor 过表达组的Raptor mRNA 和蛋白水平明显增加;茜素红染色结果显示Raptor 过表达组染色更深,说明成骨矿化程度更高;荧光定量PCR 结果显示,Raptor 过表达组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均高于对照组。与对照组相比,Raptor siRNA 组的Raptor mRNA 和蛋白水平明显降低;茜素红染色结果显示Raptor siRNA 组染色更浅,说明成骨矿化程度更低;荧光定量PCR 结果显示,Raptor siRNA 组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均低于对照组。结论:mTORC1 信号促进前成骨细胞MC3T3-E1 向成骨细胞分化成熟。     

Bone morphogenetic protein-2 counterregulates interleukin-18 mRNA and protein in MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells

Fibroblast growth factors-2 (FGF-2) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) are two of the main factors that regulate differentiation of osteoblasts. Interleukin-18 (IL-18), originally cloned as an interferon gamma-inducing factor, has been reported to inhibit maturation of osteoclasts by upregulation of osteoprotegerin secreted from osteoblasts. Little is known about the functional relationship between IL-18 and the two growth factors in osteoblast differentiation. To better understand this relationship, we analyzed the effect of BMP-2 and FGF-2 on the mRNA expression levels of IL-18, as well as IL-1alpha and IL-6, in MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells. Following this, the effects of BMP-2 on the expression of IL-18 protein and caspase-1 protein were analyzed by immunofluorescence staining. Real-time PCR and immunofluorescence staining analysis showed that FGF-2 had no effect on the expression of IL-18 mRNA and protein, but while BMP-2 reduced IL-18 mRNA levels, increased immunostaining of both IL-18 protein and caspase-1 protein was detected in BMP-2-treated MC3T3-E1 cells. Although the significance and mechanisms of this counterregulation of IL-18 mRNA and protein were not determined in this study, the increase of IL-18 protein suggested that BMP-2 may induce an active form of IL-18.     

Bone morphogenetic protein signaling in breast cancer progression

Breast cancer is the most prevalent type of cancer amongst women worldwide. The mortality rate for patients with early-stage breast cancer has been decreasing, however, the 5-year survival rate for patients with metastatic disease remains poor, currently at 27%. Here, we have reviewed the current understanding of the role of bone morphogenetic protein (BMP) signaling in breast cancer progression, and have highlighted the discordant results that are reported in different studies. We propose that some of these contradictory outcomes may result from signaling through either the canonical or non-canonical pathways in different cell lines and tumors, or from different tumor-stromal interactions that occur in vivo.     

Icariin stimulates MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation through up-regulation of bone morphogenetic protein-2

Previous studies suggest that icariin has anabolic effects on bone, but the mechanisms are unknown. We aimed to investigate the osteogenic effects of icariin in an undifferentiated osteoblast cell line by detecting cell morphology, viability, cell cycling and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) expression. We treated pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells with different concentrations of icariin [0 (as a control), 10, 20 and 40 ng/ml] for 48, 72 and 96 h. Cell morphology, viability and the cell cycle were examined and measured using microscopy, the MTT assay or flow cytometry, respectively. BMP-2-positive cells and BMP-2 protein expression levels in icariin-treated MC3T3-E1 cells were examined using immunohistochemistry staining with fluorescence optical density analysis and Western blotting. MC3T3-E1 cells showed typical characteristics of osteoblasts in response to treatment with icariin. Cells treated with all concentrations of icariin had increased percentages of S-phase cells and decreased percentages of G1-phase cells, especially in the 10 and 20 ng/ml icariin groups. The number of BMP-2-positive cells and BMP-2 protein expression levels in the 10 and 20 ng/ml icariin treatment groups were greater compared to the 0 and 40 ng/ml groups. Treatment of icariin promotes osteoblast MC3T3-E1 proliferation and differentiation in vitro, potentially owing to its role in increasing BMP-2 protein expression. Icariin potentially can be used as a drug in clinical settings to treat osteoporosis.     

骨形态发生蛋白9调控干细胞分化与骨再生

背景:骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有很强的促进干细胞成骨分化的潜能.大量研究表明,BMP9可在动物体内促进骨缺损的修复.目的:探究BM P9调控干细胞分化的机制,讨论影响BMP9促进干细胞成骨分化的潜在因素以及BMP9在骨组织工程中的应用前景.方法:在PubM...