pIRES2-BDNF-VEGF165真核表达载体的构建与鉴定

背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因,然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建为pIRES2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染 HEK293细胞,利用RT-PCR与 Western-blot 方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES- VEGF165基因片段,经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示,此载体转染后,HEK293 细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定（英文）

背景:人胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法:采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论:DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR 与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line - derived neurotrophic factor,GDNF)和血管内皮生长因子165 (vascular endothelial growth factor 165,VEGF₁₆₅)在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建双基因共表达载体pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅并对其进行鉴定。方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES₂-EGFP多克隆位点构建成为pIRES₂-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES₂-VEGF₁₆₅-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES₂-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR 与 Western-blot 方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出 IRES-VEGF₁₆₅片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF₁₆₅片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3的构建及在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3，并观察其在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达及分布。方法 用RT－PCR法，从人肝脏组织中克隆NT3-cDNA基因，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3并经PCR及EcoR I/Bam H I双酶切鉴定。用脂质体介导的方法，将用真核表达载体IRES2-EGF-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞。转染48h后，分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察转染细胞中NT－3的表达。结果 人NT－3 cDNA的PCR产物约为744bp序列测定结果用BLAST软件进行同源性比较，同源性为100％。经Eco R I/Bam H I双酶切证实，NT－3 cDNA已成功地克隆到真核表达载体IRES2-EGFP中。用脂质体介导法，将pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞，在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞。NT－3免疫组化染色结果显示，转染NT－3基因的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色；而转染空载体的成纤维细胞免疫组化染色呈阴性。结论 成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3并在豚鼠耳蜗原代成纤维细胞中表达，为NT－3基因转染治疗致聋豚鼠耳试验奠定了基础。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。 目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。 方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10 g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoR Ⅰ、xho Ⅰ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。 结果与结论：RT-PCR产物为749 bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生 749 bp和5 446 bp的片段,DNA测序证实749 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

原癌基因Bcl-2重组腺病毒的构建及表达

目的 :构建 Bcl- 2的正义和反义重组腺病毒载体 ,以研究 Bcl- 2过度表达对周围神经损伤后 ,脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和轴突再生的影响。方法 :用Eco RI酶切 p B4,0 .8%琼脂糖凝胶电泳回收0 .91kp片段 ,将该片段克隆到 pc DNA3.1质粒的 Eco RI位点 ,分别用 Eco RI和 Bam HI酶切重组 pc DNA/ Bcl- 2质粒以鉴定插入片段的大小和方向 ,正向插入被 Bam HI切出2 6 0 bp片段 ,命名为 pc DNA/ sense- Bcl- 2 ;反向插入被切入 6 5 0 bp的片段 ,命名为pc DNA/ antisense- Bcl- 2。用 Hind 和Eco R 双酶切重组的正、反质粒 ,回收 …     

shRNA表达载体的改建及鉴定

目的通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存。方法制备含有单一限制性内切酶NotⅠ识别序列的双链DNA插入片段,与BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-H1/NotⅠ,再用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pSilenc-er3.1-H1/NotⅠ,将含靶向目的基因JAK2siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用NotⅠ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被NotⅠ切开的质粒进行测序鉴定。随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达。结果通过测序证实pSilencer3.1-H1/NotⅠ和含JAK2siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达。结论通过对pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。 目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。 方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经Bam HI、Xho Ⅰ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。 结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的 构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、SalI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测.结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPAR6的高效表达.结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒.     

结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒。方法采用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B及ESAT-6基因,将其分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子重组质粒。进行酶切分析及序列测定后,用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及ESAT-6的表达。结果核酸序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及ESAT-6mRNA。结论成功构建了结核杆菌Ag85B及ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。     

Genomic cloning and restriction site mapping of a porcine adenovirus isolate: demonstration of genomic stability in porcine adenovirus

Summary Restriction endonuclease maps were constructed for the genome of a porcine adenovirus (PAV), NADC-1, which was isolated in 1972 from an adult swine. Genomic DNA libraries of NADC-1 Bam HI, Eco RI/Bam HI, and Sph I fragments were cloned into pUC-18. Using the cloned NADC-1 Bam HI and Eco RI/Bam HI fragments as probes, Southern blot hybridizations were performed to human adenovirus 2 (Ad-2) restriction fragments to determine the left-to-right orientation of the Bam HI and Eco RI/Bam HI fragments. Genomic NADC-1 DNA was cleaved with ten restriction endonucleases (RE). Using cloned NADC-1 genomic fragments as probes in Southern blot hybridizations, an RE site map was constructed. Nucleotide sequencing of four clones confirmed several RE sites. The size of the NADC-1 genome was determined to be approximately 32 kbp. The size of Hind III, Xba I, Sma I, Eco RI, Bam HI, Bgl II, Pst I, and Sph I RE fragments from NADC-1 was compared to those from the reference strain of PAV serotype 4 (F 618), and to two recent isolates, NADC-2 and NADC-3. For all restriction enzymes examined, the sizes of the NADC-1 fragments were identical to PAV-4, NADC-2, and NADC-3 fragments, indicating that the NADC-1 isolate is very closely related, if not identical, to PAV-4 and two recent isolates. Southern blot hybridizations also indicated that NADC-1, NADC-2, NADC-3, and PAV-4 are very similar and revealed regions of sequence similarity between NADC-1 and human Ad-2 and human Ad-5.     

Identification of two subtypes of HLA-DR2 by Southern blot analysis

We studied the polymorphism of HLA-DR2 by Southern blot analysis. Genomic DNA from 12 DR2 positive unrelated individuals was digested separately with five restriction endonucleases, Bam HI, Eco RI, Eco RV, Hind III and Pvu II. Hybridizing restriction fragments were visualized using radiolabeled beta-chain cDNA probes homologous to the DR and DQ subregions of the HLA. The results in the present study demonstrate that the two subtypes of DR2, DR2.1 and DR2.2, as defined by serological and cellular (PLT) techniques can be identified by Southern blot analysis. These two subtypes were identifiable after cleaving genomic DNA with Bam HI and EcoRV. DR2.1 correlated with restriction endonuclease fragments at 2.8 kb (DR beta) and 6.6 kb (DQ beta) after Bam HI digest, while DR2.2 correlated with a 2.9 kb (DR beta) and a 2.6 kb (DQ beta) restriction fragment after Eco RV digest. In addition, inheritance of the restriction fragment lengths defining DR2.1 and DR2.2 were observed in two families. In contrast, no differences between DR2.1 and DR2.2 were observed with the restriction enzymes Eco RI, Hind III and Pvu II.