小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:建立一种既可以大量制备,又易于保存并保持较高活性的饲养层细胞是人胚胎干细胞培养研究的重要环节。目的:建立昆明小鼠胚胎成纤维细胞的最佳分离培养方法,评价其用于人胚胎干细胞饲养层研究的可行性。方法:用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养昆明小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,制备胚胎成纤维细胞饲养层,检测人胚胎干细胞在饲养层上培养的生长状态。结果与结论:制备昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.5 d。不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞纯度高,增殖活跃。冻存2周,1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。小鼠胚胎成纤维细胞在第2-4代增殖旺盛,第5代以后细胞增殖活力明显下降。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞长期传代后呈典型的未分化形态,碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色均为阳性。结果表明建立的昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养法可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备**

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞生长用饲养层,优于无饲养层,它能够分泌一些既促进干细胞生长又能抑制干细胞分化的因子。 目的：建立CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳的分离培养方法,分析丝裂霉素C抑制成纤维细胞增殖的最佳浓度与时间,用于培养诱导多能性干细胞。 方法：取孕10~15 d CF-1小鼠,分离胎鼠原代成纤维细胞,经不同质量浓度(5,10,15,20 mg/L)丝裂霉素C处理不同时间(1,1.5,2,2.5,3 h)制备饲养层,并观察其增殖情况。将人诱导多潜能干细胞或胚胎干细胞在丝裂霉素C处理过的饲养层上培养,观察细胞集落生长情况。 结果与结论：制备CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.0~14.0 d。丝裂霉素C抑制CF-1小鼠胚胎成纤维细胞增殖的最佳浓度及作用时间为10 mg/L,2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持5~7 d。诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10 mg/L丝裂霉素C处理2.5 h后饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。 关键词：胚胎成纤维细胞;诱导多潜能分化干细胞;饲养层;丝裂霉素C;细胞集落 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.017     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。 目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。 方法：取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。 结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞分离培养及应用

目的探讨昆明小鼠胚胎成纤维细胞培养及应用。方法取昆明小鼠胚胎分离成纤维细胞,用丝裂霉素C处理成纤维细胞为胚胎干细胞制备饲养层,消化贴壁成纤维细胞为核移植提供供体细胞。结果13.5d、14.5d、15.5d孕鼠均可分离出成纤维细胞,14.5d孕鼠制作的成纤维细胞形态规则,3-5代成纤维细胞经处理可作饲养层,可作核移植供体细胞。结论昆明小鼠可分离成纤维细胞,用于饲养层制作及核移植供体细胞。     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6小鼠与雄性M.spretus小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系。方法:从孕12.5～14.5d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达。结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长。染色体核型检测SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性。实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对SF1-G细胞保持正常未分化状态培养。     

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养及饲养层制备

目的建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层,用于胚胎干细胞的培养。方法取孕13～15d的昆明种小鼠,分离原代成纤维细胞,在37℃时,用0.25%胰蛋白酶(含0.04%EDTA)消化组织块5min,重复消化多次,24h首次换液,培养3d后传代。采用10μg/mL丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞3h,制备出的饲养层细胞能有效地抑制胚胎干细胞的分裂,且不影响其活力。结果胎鼠分离原代成纤维细胞经10μg/mL丝裂霉素C处理后,细胞仍保持分泌多种生长因子的能力,在10d内既不增殖,也不死亡,能够很好的维持胚胎干细胞克隆的生长。结论该方法制备的饲养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境。目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞。方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件。结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10mg/L作用2.5h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12d。0.05%胰蛋白酶消化15～20min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。 目的：探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。 方法：取13.5 d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。 结果与结论：两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C 10 mg/L作用1.5~2.0 h或1 mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

不同代昆明小鼠胚胎成纤维细胞的生长特性研究

目的分离培养昆明小鼠成纤维细胞,研究其体外生长特性并用于胚胎干细胞培养。方法消化法分离培养获得昆明小鼠胚胎成纤维细胞,利用MTT法绘制各代细胞生长曲线,免疫荧光对各代细胞进行细胞骨架分析;用不同浓度丝裂霉素C(10μg/m L、20μg/m L和30μg/m L)分别处理MEFs 1、2、3 h,MTT法筛选饲养层制备的最佳条件,制备饲养层用于小鼠胚胎干细胞的培养。结果分离的小鼠胚胎成纤维细胞3～5代细胞增殖能力较好; 1～3代细胞微管微丝排列整齐,5代以后的细胞微管微丝排列紊乱; 10μg/m L丝裂霉素C处理2 h有利于小鼠胚胎干细胞的培养。结论体外分离培养的3～5代小鼠胚胎成纤维细胞可用于小鼠胚胎干细胞的培养。     

诱导多能干细胞培养中饲养层制备的条件优化

目的建立分离培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast MEF)的体系,探讨诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)培养所需饲养层的最佳制备方法,制备高质量的IPSC饲养层细胞。方法采用胰蛋白酶消化法,将昆明小鼠胚胎制成细胞悬液接种培养。用不同浓度的丝裂霉素C处理MEF细胞制备饲养层,观察处理后的细胞活力及有无再增殖现象,在制备的饲养层细胞上接种IPS细胞,观察各组IPS细胞生长状态。结果采用0.0625%胰蛋白酶消化孕12.5-14.5d雌鼠胚胎组织获得高活力的MEF细胞,用15μg/ml的丝裂霉素C处理后MEF细胞无明显增值,细胞活力在90%以上,其IPS细胞生长状况最好,效果最佳。结论该方法可获得高活力的MEF细胞。15μg/ml的丝裂霉素C处理1.5h后的MEF细胞制成的饲养层最适于IPS细胞生长。     

小鼠胚胎干细胞饲养层培养体系的优化筛选

目的：建立小鼠胚胎干细胞饲养层培养体系。方法：用5种不同鼠胚成纤维细胞为饲养层，进行小鼠胚胎干细胞的分离培养，观察5种饲养层培养体系对小鼠胚泡发育，内细胞团增殖及胚胎干细胞分离培养的作用。结果：原代或冻存复苏后的原代培养鼠胚成纤维细胞用于制备饲养层，有利于胚泡的贴壁，孵化，内细胞团增殖形成巢式生长集落，离散后培养，可以观察到胚胎干细胞集落的出现，并可在短期内维持胚胎干细胞的正常形态，不发生分化，与其他三组有明显差异。结论：原代或冻存复苏后的原代培养鼠胚成纤维细胞饲养层是用于胚胎干细胞分离培养的有效的培养体系。     

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：极小胚胎样干细胞是近年来发现的一种具有类似胚胎干细胞生物学特性的非造血干细胞,但对其体外培养扩增的方法报道极少。有研究推测,人胚胎成纤维细胞能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。 目的：从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞,制备人胚胎成纤维细胞饲养层用于人骨髓极小胚胎样干细胞的培养。 方法：利用胰酶消化法从孕5-9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞。制作饲养层,使用不同浓度丝裂霉素C处理后,用于培养分选后的人骨髓极小胚胎样干细胞,以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标。 结果与结论：从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞,该细胞可传代24代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变。丝裂酶素C低于12 mg/L时,人胚胎成纤维细胞增殖不能完全抑制;高于14 mg/L,人胚胎成纤维细胞可能死亡。12 mg/L丝裂霉素C作用3 h后能较好地抑制人胚胎成纤维细胞的增殖,并且保持其活力约2周,可以在很长一段时间内用作人骨髓极小胚胎样干细胞的饲养层。     

饲养层细胞体系及白血病抑制因子对维持小鼠胚胎干细胞未分化状态的作用

目的建立并筛选最适合的小鼠胚胎干(ES)细胞饲养层培养体系。方法建立7种经过不同处理的鼠胚成纤维细胞作为饲养层培养体系,分别进行小鼠胚胎干细胞的培养,观察7种饲养层培养体系对小鼠ES细胞增殖能力及未分化状态的维持情况。结果小鼠胚胎细胞在3代内均可用于ES细胞的培养。与其他各组比较,第3代培养鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理2h后加外源白血病抑制因子(IF,10μg/ml)用作饲养层的克隆形成率和碱性磷酸酶(AKP)染色阳性度最高。结论外源性白血病抑制因子是抑制小鼠ES细胞分化的主要因素。     

Amniocytes can serve a dual function as a source of iPS cells and feeder layers

Clinical barriers to stem-cell therapy include the need for efficient derivation of histocompatible stem cells and the zoonotic risk inherent to human stem-cell xenoculture on mouse feeder cells. We describe a system for efficiently deriving induced pluripotent stem (iPS) cells from human and mouse amniocytes, and for maintaining the pluripotency of these iPS cells on mitotically inactivated feeder layers prepared from the same amniocytes. Both cellular components of this system are thus autologous to a single donor. Moreover, the use of human feeder cells reduces the risk of zoonosis. Generation of iPS cells using retroviral vectors from short- or long-term cultured human and mouse amniocytes using four factors, or two factors in mouse, occurs in 5-7 days with 0.5% efficiency. This efficiency is greater than that reported for mouse and human fibroblasts using similar viral infection approaches, and does not appear to result from selective reprogramming of Oct4(+) or c-Kit(+) amniocyte subpopulations. Derivation of amniocyte-derived iPS (AdiPS) cell colonies, which express pluripotency markers and exhibit appropriate microarray expression and DNA methylation properties, was facilitated by live immunostaining. AdiPS cells also generate embryoid bodies in vitro and teratomas in vivo. Furthermore, mouse and human amniocytes can serve as feeder layers for iPS cells and for mouse and human embryonic stem (ES) cells. Thus, human amniocytes provide an efficient source of autologous iPS cells and, as feeder cells, can also maintain iPS and ES cell pluripotency without the safety concerns associated with xenoculture.     

人胚胎干细胞饲养层培养体系的研究进展

人胚胎干细胞(hES细胞)来源于着床前人囊胚内细胞团(ICM),由于具有体外无限增殖和分化成3个胚层来源的各种细胞的潜能,使其成为当今生命科学的研究热点.建立一个理想的hES细胞培养体系是利用它的前提.目前,最常用的hES细胞的体外培养方式是将其培养在饲养层细胞上.迄今为止,已经有多种细胞用于hES细胞的体外培养.饲养...     

Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers

To date, all human embryonic stem cells (hESCs) available for research require unidentified soluble factors secreted from feeder layers to maintain the undifferentiated state and pluripotency. Activation of STAT3 by leukemia inhibitory factor is required to maintain "stemness" in mouse embryonic stem cells, but not in hESCs, suggesting the existence of alternate signaling pathways for self-renewal and pluripotency in human cells. Here we show that activin A is secreted by mouse embryonic feeder layers (mEFs) and that culture medium enriched with activin A is capable of maintaining hESCs in the undifferentiated state for >20 passages without the need for feeder layers, conditioned medium from mEFs, or STAT3 activation. hESCs retained both normal karyotype and markers of undifferentiated cells, including Oct-4, nanog, and TRA-1-60 and remained pluripotent, as shown by the in vivo formation of teratomas.