粪便基因组DNA提取方法比较及在沙门菌定量PCR检测中的应用

目的 建立并优化1种可用于临床微生物检测的粪便微生物基因组DNA提取方法并应用于沙门菌定量PCR快速检测.方法 分别利用土壤微生物基因组DNA提取试剂盒法、微生物基因组DNA提取试剂盒法和本实验室改进酚/氯仿抽提法提取腹泻患者粪便基因组DNA,根据沙门氏菌16srDNA、 dT等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,进行多基因定量PCR检测.结果 3种方法提取的基因组DNA均可进行有效的定量PCR扩增,采用所建立的多重PCR方法可特异鉴别粪便沙门氏菌.结论本研究改进的粪便基因组DNA提取方法及临床微生物的定量PCR检测可在较短的时间内实现对大量临床样品快速诊断,有一定应用前景.     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

志贺菌6种毒力基因的多重PCR检测

目的:建立志贺菌6种毒力基因[志贺菌肠毒素I基因(setl)、志贺菌肠毒素2基因(sen)、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关蛋白基因(ial)、志贺毒素1基因(stxl)及调控基因(virA)]的多重PCR鉴定方法,实现多基因的同时检测.方法:选掸志贺菌的6种毒力基因作为靶基因,以A群和C群4株标准及B群和D群4株临床分离株为模型,应用降落PCR方法在1个反应管中同时进行扩增,根据扩增片段大小定性判断结果.通过样本倍比稀释检验多重PCR的灵敏性,并在NCBI网站上用BLAST检索各引物的特异性.另选取河南省2001年至2007年115株志贺菌进行多重PCR检测,以验证多重PCR的可行性.结果:多重PCR能同时检测上述6种毒力基因,与单基因PCR分别检测6种毒力基因相比具有相近的灵敏度与特异性.应用多重PCR方法检测115株志贺菌,除stxl外,其余5种毒力基因的阳性率均在85%以上.结论:多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究.     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌的研究

目的建立了一种基于颜色判定的,能够快速准确地检测铜绿假单胞菌的LAMP方法。方法针对铜绿假单胞菌OprL基因设计3对LAMP引物,通过引物特异性识别OprL的8个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌。如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein),其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证。对该技术进行特异性、灵敏度分析,利用LAMP和PCR同时检测临床标本。结果设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因的恒温扩增检测方法。本恒温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性。其最低检测限为17.414 pg/μl,PCR方法最低检出限为174.414 pg/μl,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高。LAMP法对临床阳性标本检出率与PCR法相当(27/27)。结论 LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的建立与应用

目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝／反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0．183％。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99．5％以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。     

多重qPCR在快速检测临床常见病原菌中的应用

目的 构建基于多重实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测9种临床常见病原菌的体系。方法 针对达州市中心医院2021年1月至2021年12月分离的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌等9种临床常见病原菌进行特异性引物和探针的设计，通过多重q PCR检测不同拷贝数的病原菌，利用PCR特异性和抗干扰能力强的优点，建立病原菌快速检测的多重qPCR反应体系，并用阳性样本进行验证。结果 9种病原菌的多重q PCR检测灵敏度可达5 Copies，重复性良好。通过对构建的体系进行特异性和抗干扰能力检测，发现该系统能够在杂菌的干扰下特异性地检测出病原菌，抗干扰能力强。最后通过对9份阳性病原菌样本进行检测，准确率达100%。结论 本研究通过针对临床9种常见病原菌多重q PCR快速检测方法的构建，能够及时准确地获得病原菌的鉴定结果，对于早期合理使用抗生素具有重要意义。     

常见曲霉菌的反向斑点杂交技术的研究

目的 建立常见曲霉菌的反向斑点杂交诊断技术.方法 针对曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和杂交探针,对探针标记、固定在尼龙膜,形成一种杂交膜与PCR产物进行斑点杂交,显色.结果 真菌通用引物扩增常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350bp左右.构建了常见曲霉菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高.结论 利用PCR技术和反向斑点杂交技术鉴定常见的曲霉菌,方法特异性好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染提供新的选择.     

增菌PCR法检测小鼠沙门氏菌

根据沙门氏菌 inv A基因序列合成一对寡核苷酸引物 ,建立了增菌 PCR法检测实验动物粪便沙门氏菌的方法。首先以 7种常见的沙门氏菌及 3种非沙门氏菌标准菌株检验了 PCR法的特异性和灵敏度。 7种沙门氏菌扩增出 2 84bp的特异区带 ,非沙门氏菌皆无特异带扩增 ,检测灵敏度为 5 0个 CFU。比较了不同方法即差速离心集菌、玻璃粉吸附和选择性增菌处理粪便样品制备模板 DNA,相应于 3种方法的 PCR检测灵敏度分别为 :2× 1 0 4 ,5× 1 0 3,1 0个 CFU。然后 ,用增菌 PCR法与分离培养法对比检测了 1 0 5只实验动物。在 80只 KM小鼠中 ,分离培养法检出 1 0只阳性 ,PCR法检出 1 2只阳性 ,高于分离培养法。结果提示 :增菌 PCR法在大批量的实验动物沙门氏菌的快速检测中具有应用价值     

多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌

目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。     

聚合酶链反应技术检测阴道毛滴虫的研究

目的:建立PCR检测阴道毛滴虫的方法.方法:按照滴虫TV-E650-1基因设计一对引物,采用PCR技术扩增滴虫目的基因,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据扩增及电泳结果判断PCR法体外诊断阴道毛滴虫感染的可行性.同时,通过与其它常见阴道微生物PCR结果对比,判断所设计引物的特异性;根据模板DNA的稀释倍数判断引物的敏感性.结果:设计的一对引物以滴虫DNA为模板,扩增出大小为438 bp的基因片断,与目的基因相符;空白对照扩增阴性.以乳酸杆菌、大肠杆菌、阴道加德纳菌等阴道常见微生物DNA为模板,扩增结果均为阴性.将滴虫DNA稀释至1 000倍(相当于1.36 pg/μL)仍可见明显扩增.结论:PCR检测滴虫方法可行,且准确,特异性好,敏感性高,能用于临床批量检测,可作为体外诊断阴道毛滴虫感染及流行病学调查的候选方法.     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

食源性致病菌沙门氏菌与奇异变形杆菌二重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测食物中致病菌奇异变形杆菌与沙门氏菌的双重PCR方法。方法根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）和沙门氏菌属侵袭性抗原保守基因（invA）设计特异性引物,建立其双重PCR检测方法,并对反应条件进行优化。结果两对引物分别能扩增出374 bp和724 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,两菌可同时检出的浓度限度为104cfu/ml。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食物中奇异变形杆菌与沙门氏菌的快速诊检和监控。     

细小病毒B19的芯片检测方法构建

 目的   运用基因芯片技术构建快速简便检测B19 细小病毒的方法,用于B19 病毒的大规模筛查和早期诊断。方法  利用Oligo6.0和primer5.0 软件分别设计出5 对引物（其中每对引物中的1 个用Cy5 标记）和6 个探针,将探针固定在特制的醛基检测芯片上。分别提取B19 病毒全基因组质粒、患者组血清、正常组血清的DNA,进行不对称扩增,产物与芯片杂交,观察结果;DNA测序验证芯片检测结果的准确性;观察等倍稀释不对称PCR 扩增产物杂交信号的强度变化,检测芯片的灵敏度。结果  电泳结果表明PCR扩增获得的DNA片段和预期表达片段大小一致。芯片杂交结果和DNA测序验证结果完全吻合,芯片杂交信号的强弱会随着DNA浓度的降低而减弱。结论  本研究建立了细小病毒B19的芯片检测方法,该方法并具有较高的灵敏度和特异性。     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。     

快速检测肺炎链球菌recA、ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的：建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法：设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100％,灵敏度达5pg／μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论：成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。     

食源致病菌96 微孔板DNA 诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件中的应用

目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。