人骨髓间充质干细胞分离培养方法的改进

背景：当前分离培养骨髓间充质干细胞方法的有多种,但在外科手术中进行获取的方法仍然较少,而外科分离所得细胞对于相应疾病的具有揭示原因和提供研究线索的价值。 目的：在骨科手术中以直接贴壁差速贴壁分离培养纯化与鉴定骨髓间充质干细胞。 方法：在骨科关节置换等大手术中吸取少量人骨髓血,采用直接贴壁法分离骨髓间充质干细胞,在贴壁后36~48 h行洗盘处理,并通过长期体外培养,特定培养基自身的筛选作用对细胞进行筛选,当细胞生长达到足量时进行鉴定。 结果与结论：采用直接贴壁法能够在长骨髓腔内混合血中分离培养骨髓间充质干细胞并形成集落,其形态学表现和表面分子经鉴定符合骨髓间充质干细胞特点,能够获得符合要求的人骨髓间充质干细胞,从而进行后续实验。     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立

目的建立培养小鼠骨髓间充质干细胞(none mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养方法。方法采用全骨髓体外分离并采用差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠BMSCs,形态学观察细胞生长情况,流式细胞仪检测其表面抗原情况并观察其多项分化潜能。结果使用该方法纯化扩增的BMSCs形态均一,生长良好,表达CD29、CD44和Sca-1,不表达CD11b、CD45和CD34,并具有成骨成脂潜能。结论通过全骨髓贴壁法可以成功的分离培养出小鼠BMSCs。     

骨髓神经组织定向干细胞的分离培养鉴定

目的:为临床中枢神经系统疾患的细胞移植及组织工程修复周围神经提供一种应用广泛、可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德等问题的移植用种子细胞。方法:采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞培养液,通过先贴壁、后悬浮的方法从大鼠骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells,NTC-SCs),通过免疫细胞化学检测NTCSCs细胞球CXCR4和Nestin蛋白,以及细胞球自然分化后神经元β-TublinⅢ、MAP2ab以及神经胶质细胞CNPase、GFAP等蛋白的表达。结果:NTCSCs细胞球表达神经干细胞标志蛋白Nestin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4;NTCSCs细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化,免疫荧光显示神经元和神经胶质蛋白β-TublinⅢ、MAP2ab、CNPase、GFAP等标志物阳性。结论:本研究提供了一种操作简便、成本低廉的NTCSCs的分离培养方法,NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。     

新型骨基质材料复合骨髓基质干细胞体外培养的形态学观察

目的：新型有机-无机复合类骨基质材料(New Bone-matrix Material，NBM)的研制及其细胞相容性的初步检测，为骨组织工程探寻一种新型复合类细胞外基质材料提供实验依据。方法：应用组织培养技术，对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cell，BMSC)和NBM体外联合培养进行相差显微镜观察和扫描电镜观察。结果：骨髓基质干细胞可以在NBM材料上发生良好的粘附、增殖，并能长入材料的孔隙内，分泌大量的细胞外基质成份。结论：NBM是一种新研制的有机-无饥复合类骨基质材料，具有网状孔隙结构；在体外与BMSC复合培养时表现出良好的细胞相容性，对细胞的粘附、增殖和功能表达未见明显影响。     

成年大鼠和恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养及鉴定

本实验目的是比较成年大鼠和恒河猴骨髓基质干细胞(MSCs)原代培养的细胞形态和生长状况的差异。分别分离成年大鼠和恒河猴的骨髓,密度梯度离心法分离MSCs,传代培养。在细胞生长过程中显微镜观察两种细胞形态及生长状况的差异,并分别进行成脂及成骨诱导。结果表明,在相同的培养条件下,成年大鼠和恒河猴MSCs原代培养细胞形态比较接近,但细胞原代及传代生长状况有差异。大鼠MSCs原代培养及细胞冻存后复苏的生长均快于猴的MSCs。两种动物的细胞都可以向脂肪和成骨细胞分化。猴的MSCs因其生长缓慢和细胞形态的明显改变,需改良其培养条件,才能用于进一步的研究。     

SD大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化的初步实验研究

以 SD大鼠为实验对象 ,从其骨髓分离出骨髓基质细胞 (BMSC) ,利用 L IF、b FGF、RA等增殖及分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导 ,观察 SD大鼠骨髓基质细胞体外培养的生长行为及扩增、分化情况。我们观察到 ,分离得到的骨髓基质细胞在体外培养中能形成细胞克隆团 ,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞经传代后 ,其数量明显多于原代培养 ;BMSC经持续培养具有增殖能力以及分化为组织细胞的潜能 ,其分化细胞形态多样 ,包括胶质细胞样细胞和神经元样细胞。实验结果证明 ,骨髓基质细胞具有较强的自我更新的能力和多分化能力 ,也说明本实验所采用的细胞培养方法适用于骨髓基质细胞的体外生存与扩增。骨髓基质细胞较容易取材、体外培养和扩增 ,并具有多向分化潜能 ,在合适的诱导分化条件下 ,可分化出神经细胞 (神经元和神经胶质细胞 ) ,是理想的种子细胞     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定***☆

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。 目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。 方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。 结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1∶3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。 关键词：单克隆培养;骨髓基质干细胞;多能成体干细胞;鉴定;分化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.008     

成人骨髓基质干细胞体外成骨细胞分化诱导

建立成人骨髓基质干细胞分离、扩增,以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源.抽取健康成人骨髓组织,用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含体积分数为10%小牛血清的高糖DMEM培养液中,置于37℃、含体积分数为5%的CO2湿化空气孵箱中培养,通过传代培养扩增骨髓基质干细胞,传三代时改用含地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C的条件培养基培养,用倒置显微镜、HE染色观察增殖和分化情况,并测定碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力.采用本法在体外培养的成骨细胞生长良好,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性.本研究所建立的成人骨髓基质干细胞分离、扩增,以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法稳定和实用,可作为骨组织工程种子细胞来源的常规方法之一.     

骨髓基质干细胞培养、鉴定及标记的初步研究

目的：对骨髓基质干细胞的培养方法、鉴定及标记技术进行初步研究。方法：采用贴壁法培养大鼠骨髓细胞，经反复传代细胞逐渐纯化，以流式细胞术检测细胞表面抗原。以BrdU标记骨髓基质干细胞，将骨髓基质干细胞注入大鼠脑内，2周后取脑作石蜡切片，进行免疫荧光染色。结果：通过贴壁法培养大鼠骨髓细胞可获得较纯化的细胞，并能在体外长期培养，流式细胞术检测显示CD34、CD31、CD45阴性，CD90、CD44、CDT1阳性。BrdU可掺入DNA合成期的骨髓基质干细胞。结论：贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞，BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的分离培养山羊的问充质干细胞，并为其在骨组织工程研究中的应用奠定基础。方法应用常规的密度梯度离心法结合贴壁培养法从山羊骨髓中分离间充质干细胞，并通过观察分离培养细胞的形态，检测其表面的CD分子表达，以及RT—PCR和免疫组化病理染色方法证实成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能来对细胞进行鉴定。结果分离的细胞具有成纤维细胞样形态，第三代细胞的表面分子CD29和CD44阳性率为98．70％、99．54％，而CD62L和CD45阳性率为1．10％和0．73％。RT-PCR和免疫组化病理染色证实分离细胞具有成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能。结论成功地分离培养山羊的骨髓间充质干细胞，使山羊间充质干细胞应用于骨组织工程的研究成为可能。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Isolation,culture and osteogenic induction of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。 目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。 方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1.073 g/mL的Percoll分离液,3 000 r/min×30 min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2 000-2 500 r/min×(20-30) min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养。 结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组(P < 0.05)。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

骨髓间充质干细胞诱导成肌的研究进展

骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种取材方便,易于培养的多能干细胞,研究者一直在探索MSCs向肌源性细胞诱导分化的方法,通过生物化学诱导、生物力学刺激诱导等多种方法可使MSCs向肌细胞分化,应用于临床,治疗缺血性心肌病及肌组织创伤后的修复。就目前MSCs诱导成肌方面的研究以及MSCs的分离、纯化及鉴定作一综述。     

骨髓间充质干细胞分离培养的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能。随着对其细胞免疫学研究的深入 ,目前已建立了多种分离纯化并扩增的方法 ,为其在细胞工程和组织工程上的应用提供了基础     

骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的潜能

背景：研究表明,在一定条件下骨髓间充质干细胞可诱导分化为肝样细胞,为治疗急性肝衰竭等终末期肝病提供了新的思路。 目的：对骨髓间充质干细胞的发现、分离培养、诱导分化及应用前景等方面做一综述。 方法：计算机检索中国期刊网全文数据库以及PubMed数据库1999至2014年期间有关骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的文章。检索词分别为“肝样细胞,骨髓间充质干细胞,细胞分化”和“hepatocyte-like cells,bone marrow mesenchymal stem cells,differentiation”。最后选择52篇文章纳入结果分析。 结果与结论：目前,肝组织工程的首要问题是寻找性状稳定具有肝特异性功能的种子细胞,成熟肝细胞获取难度较大,并具有产生免疫排斥反应、体外培养困难等缺陷,严重限制了肝移植的开展。骨髓间充质干细胞具有多向分化、自我更新快、易于扩增及培养等优点,被认为是最有前途的细胞来源。已有研究表明骨髓间充质干细胞在体内外均可分化为肝细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能。但如何大量扩增此类细胞的同时又能保持其良好的分化潜能、体外培养的最佳条件、诱导分化机制和临床应用的安全性等尚需进一步研究和探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞

背景：有研究向骨髓液中加入红细胞裂解液来提高分离纯化骨髓间充质干细胞的效率,以期获得纯度高、数量多的骨髓间充质干细胞。 目的：进一步验证红细胞裂解液法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的增殖特性,并对其进行细胞生物学鉴定。　 方法：使用红细胞裂解液提取含有兔骨髓间充质干细胞的骨髓悬混液,于4,7,10,13 d记录比较原代细胞的生长相对数量;观察传代细胞的生长情况,绘出P2、P3、P4及P5代细胞的生长曲线,比较各代细胞的增殖特点;倒置相差显微镜观察细胞的形态,细胞免疫荧光及流式细胞仪检测所获得细胞的CD44、CD34表面抗原的表达情况。 结果与结论：红细胞裂解液法所获得的兔骨髓间充质干细胞为均一规则的以梭形为主的贴壁细胞,其胞核胞核均质、核仁明显、胞浆丰富,且CD44抗原表达阳性、CD34抗原表达阴性;原代细胞生长曲线呈类“S”型;P4代细胞具有较好的增殖活性,其生长速度、所获取的细胞数量均优于其他代数细胞。说明红细胞裂解液法可以在体外较好的培养出骨髓间充质干细胞,其P4代细胞是骨髓间充质干细胞增殖能力最强的一代细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞成骨分化调控的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能 ,其应用是目前国际上组织工程领域中重要的研究内容之一。近年来 ,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究 ,取得了较大的进展