人胃黏膜组织蛋白质组二维电泳图像的获得

目的初步建立并优化人类胃黏膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法刮取手术胃黏膜组织，对以固相pH梯度为第一向的双向凝胶电泳的关键因素与环节，如样品处理、上样量、电泳参数、凝胶浓度和SDS凝胶电泳染色方法等进行一系列的优化。以固相pH梯度——IPG胶条(pH=3—10)进行第一向等电聚焦，以SDS均一胶(13％)的垂直电泳为第二向。结果成功地得到了胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化

目的建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性。方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦（IEF）为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化。结果两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数（678±32）个,非还原烷基化蛋白质斑点数（358±26）个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰。结论还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化

目的 建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性.方法 采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦(IEF)为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化.结果 两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数(678±32)个,非还原烷基化蛋白质斑点数(358±26)个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰.结论 还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用.     

肺腺癌SPC-A1细胞双向电泳图谱的优化

双向电泳技术＋质谱技术已经成为蛋白组学研究的基本策略之一。获得细胞或组织经过某种处理前后的双向电泳图谱，然后经专业2－D图像分析软件找到差异表达（有无的差异或是表达量的差异）的蛋白质斑点，再经过质谱分析鉴定这些蛋白质的种类，可以全面、系统地研究该处理因素对总蛋白质表达的影响。而要想准确地获得某种组织或细胞的双向电泳图谱，建立与之兼容的方法必不可少。本文通过使用和SPC－A1细胞株兼容的总蛋白质抽提方法，采用不同pH梯度的IPG（immorbilized pH gradient）干胶条，获得了较为清晰的蛋白质斑点，并重点分离了特定局部区域的蛋白质，优化了本细胞株的双向电泳图谱，为进一步分析药物处理前后的总蛋白质表达差异创造了条件。     

建立人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳的分离体系

背景:双向电泳分离技术是蛋白质组学研究的核心技术之一,但蛋白质样品的分离效果受各种实验条件的影响较大。因此,针对不同来源的蛋白样品进行实验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱。目的:拟建立优化的人肾小管上皮细胞株蛋白质组双向电泳分离体系。方法:常规培养人肾小管上皮细胞株HK-2细胞并裂解提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整。改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化。结果与结论:通过对实验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高的分辨率和重复性的人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系。其中,优化后的裂解液配方成分为1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;采用pH4～7的IPG胶条;上样方式选择被动的水化上样。等电聚焦过程中使用预设的缓慢升压模式,充分聚焦后选用合适的电压模式进行SDS-PAGE电泳,然后采用改良硝酸银法进行染色,最终获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。     

脑瘤患者脑脊液肿瘤相关蛋白的蛋白质组学初步研究

通过比较脑肿瘤患者和正常人脑脊液的二维凝胶电泳图谱（two-dimensional electrophoresis,2DE）,并对差异蛋白进行质谱鉴定,以寻找肿瘤特异脑脊液蛋白。以脑肿瘤患者和正常人的脑脊液为研究对象,采用固相pH梯度（immobilized pH gradient,IPG）2DE分离总蛋白质,凝胶经银染显后,用ImageMaster2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质。结果得到肿瘤患者脑脊液蛋白点924个,正常脑组织蛋白点507个,匹配512个,匹配率分别为55．4％和84．3％,去冗余后发现,有35个蛋白点只在脑肿瘤患者脑脊液图谱中出现。肿瘤患者脑脊液和正常对照脑脊液双向电泳图谱有明显差别,但是本实验尚未对这些差异蛋白进行质谱鉴定,所以未找出肿瘤特异蛋白。     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景：氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。 目的：建立以双向电泳结合Western blot及生物质谱技术分离、鉴定人脑氧化修饰蛋白质的方法。 方法：取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,固相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶上免疫荧光显色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱鉴定氧化修饰蛋白质。 结果与结论：从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3-磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酮酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了用蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

肺腺癌和癌旁组织蛋白质表达谱差异的研究

通过比较肺癌患者癌组织和癌旁组织的二维凝胶电泳图谱(two-dimensional electrophoresis,2DE),以寻找肺癌相关蛋白、肺癌患者癌组织和癌旁组织,采用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)2DE分离总蛋白质,凝胶经银染显后,ImageMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质并进行质谱鉴定获取肺癌相关蛋白信息。结果分析得到肺癌组织蛋白点709个,癌旁组织蛋白点722个,选择表达量差异达3倍以上的40个,进行胶内酶解,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI TOF MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,得到7个肺癌标志物的候选蛋白,但这些差异蛋白点在肺癌发生发展中的作用需要进一步研究。     

强直性脊柱炎的外周血CD4+T淋巴细胞双向电泳技术

目的 优化双向凝胶电泳的实验步骤,总结出一套适用于强直性脊柱炎的外周血CD4+ T细胞的双向凝胶电泳技术.方法 对双向电泳实验中的关键环节:样本处理,上样方法,聚焦条件等进行调整与优化,硝酸银染色后进行凝胶图像比较.结果 采用pH4-7胶条,用免疫磁珠分离外周血CD4+ T 淋巴细胞,Cleaning-up试剂盒沉淀蛋...     

人晶状体上皮细胞蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定

目的： 建立人晶状体上皮细胞蛋白质组研究体系，探讨双向电泳和质谱鉴定技术在人晶状体上皮细胞蛋白质组研究中的作用。 方法: 体外培养人晶状体上皮细胞株，用两种不同方法提取总蛋白，进行固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳，凝胶通过GS-800扫描仪（Bio-Rad）获取图像并使用PDQuest专业图像分析软件分析。在此基础之上，胰酶消化蛋白质斑点并进行质谱分析。 结果: 获得了重复性较好的人晶状体上皮细胞蛋白质组电泳图谱。晶状体蛋白质斑点在等电点pH值为4-7、相对分子质量为17-72 kD之间均有分布。其中高丰度蛋白点主要分布于分子量19-50 kD、PI 5-7范围内。2个蛋白点通过质谱分析和数据库的检索得到了初步的鉴定。 结论: 建立起了一个稳定的分析人晶状体上皮细胞蛋白质组学实验体系；为进一步研究人类晶状体在生理状态及白内障等病理条件下的改变提供了蛋白质组学的研究方法和途径。     

蛋白质样本制备及IEF时样本上样对乳腺癌蛋白质2-DE分离结果的影响

目的通过对蛋白质样本制备及IEF蛋白质上样时几个重要环节进行探讨,为乳腺癌组织蛋白质样本2-DE分离结果优化提供重要的实验与理论的依据。方法通过Bio-Rad公司提供的试剂盒对乳腺癌组织进行总蛋白提取、蛋白质纯化、蛋白质定量,并分别对处理前后的乳腺癌蛋白质样本进行SDS-PAGE与2-DE分离。结果乳腺癌组织蛋白质的等电点主要集中在pI5~8范围内,SDS-PAGE、蛋白质样本纯化与定量等措施及适当的IEF上样体积与上样量可获得良好的2-DE蛋白质分离结果。结论样本制备是2-DE蛋白质分离的关键,准确的取材、蛋白质样本的SDS-PAGE质量监测、适量的样本上样体积与上样量、适当的pH值范围的IPG胶条的选择以及采用蛋白质纯化试剂盒对蛋白质样本进行纯化与浓缩是整个实验成功的保证。     

Application of two-dimensional electrophoresis in the research of retinal proteins of diabetic rat

Diabetes mellitus （DM） is a chronic disease which is associated with numerous serious health complications such as diabetic retinopathy, and is the leading cause of new cases of blindness in adults at the age of 20-74 years old. The aim of the study was to establish and optimize a two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis （2-DE） technique for retina proteomics to improve the resolution and reproducibility, and to observe the proteomic changes of retinal tissues in diabetic and normal rats. Proteins were extracted from retinal tissues of normal and 8 weeks diabetic SD rats and used in two-dimensional electrophoresis. Various conditions of retina proteomic 2-DE were adjusted, optimized and protein spots of differential expression were obtained through analysis of 2-DE images with PDQuest software. By choosing appropriate sample amount, using pre-cast IPG dry strips （pH 5-8） and casting 12% equal gel, satisfactory 2-DE images of retina were obtained and a steady 2-DE technique was established. In this way, we found 36 spots in 2-DE gel of diabetic retinas that exhibited statistically significant variations, including up-regulation of 5 proteins in diabetic rat retinas, down-regulation of 23, and disappearance of 8, in comparison with normal tissues. The differences of protein expression were observed in retinas between diabetic and normal rats. Our established 2-DE technique of retina proteins could be effectively applied in proteomics of retina diseases. Cellular ＆ Molecular Immunology. 2007;4（1）：65-70.     

霍乱弧菌O1群有毒株和无毒株的蛋白质谱特征分析

目的 利用双向电泳和质谱鉴定技术探讨环境和人体中霍乱弧菌蛋白表达的差异.方法 利用适当的裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得双向电泳图谱,并利用ImageMaster 2D Elite 5.0图像分析软件进行分析,所得的数据采用SPSS15.0进行统计分析,找出差异蛋白;在此基础上,胰蛋白酶消化这些特殊差异蛋白,并进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析.结果 获得1032±22个蛋白斑点,蛋白主要集中在等电点(PI)4.00～7.20之间,重复胶的匹配点数为1025±24,匹配率为96.30%;发现了有明显差异的21个蛋白点,并用质谱鉴定了其中4种蛋白.结论 获得了环境和人体中霍乱弧菌蛋白的差异表达蛋白.     

霍乱弧菌菌体蛋白双向电泳技术的建立

目的建立霍乱弧菌全菌体蛋白的双向电泳技术，获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱。方法利用适当的裂解液处理霍乱弧菌，提取全菌蛋白；采用pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳；考马斯亮蓝染色后获得的双向电泳图谱，并利用ImageMaster 2D Elite5．0图象分析软件进行分析，所得的数据用SPSS15．0进行统计分析。结果得到了（1081±16）个蛋白斑点，蛋白主要集中在pI4．24～7．20之间，重复胶的匹配点数为（1057±28），匹配率为97．85％。结论建立了霍乱弧菌全菌双向电泳分析方法，2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性非常高，获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱，为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础。     

霍乱弧菌O1群稻叶型流行株和非流行株的蛋白质谱特征分析

目的探讨霍乱弧菌01群稻叶型流行株和非流行株的蛋白表达的差异。方法利用裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得的双向电泳图谱,并利用ImageMaster2DElite5．0图象分析软件进行分析,找出差异蛋白;在此基础上,胰蛋白酶消化这些特殊差异蛋白,并进行质谱（MALDI-TOF—MS）分析。结果获得了（1081±16）个蛋白斑点,蛋白主要集中在pI4．00—7．20之间,重复胶的匹配点数为（1057±28）,匹配率为97．85％;发现了有明显差异的21个蛋白点,并进行了质谱鉴定。结论获得了霍乱弧菌01群稻叶型流行株和非流行株的差异表达蛋白。     

CCKB受体诱发的小鼠神经元蛋白质磷酸化的研究

目的：从蛋白质可逆磷酸化修饰的角度初步勾勒出CCK_B型受体介导的胞内信号转导途径。方法:培养的小鼠大脑皮质神经元分为实验组、对照组和受体拮抗剂组，在无磷培养基加入 ［32P］-NaH₂PO₄标记细胞中的磷蛋白后，刺激组给予CCK₈（10^-7 mol/L），对照组加入等量的无磷培养基，受体拮抗剂组在分别加入CCK_A型、CCK_B型受体拮抗剂L364 718、L365 260以及L364 718＋L365 260，浓度均为10^-8 mol/L，孵育10 min后，再加入10^-7 mol/L CCK₈，37 ℃作用60 min，液氮中终止磷酸化反应。裂解细胞提取蛋白质，双向电泳分离，放射自显影7d后，获得磷酸化蛋白的放射自显影双向电泳图谱。采用PDQuest 2D分析软件对图谱进行差异分析，并在Swiss-Prot蛋白质数据库和自建磷蛋白数据库中查询定性。结果:CCK₈作用60 min后，小鼠神经元CCK₈信号转导相关磷酸化蛋白有：多种蛋白激酶、细胞信号分子、生长因子受体、转录因子等。加入L364 718后，神经元中PKCδ、P55G等的磷酸化水平降低，加入L365 260后， PKCα、PKGβ、OGFR、EGFR等的磷酸化水平呈现不同程度的降低，表明皮质神经元中CCK_B受体介导的信号转导更复杂。结论:CCK_A型、GGK_B型受体均可介导CCK₈在神经元的信号转导，但CCK_B型受体可能发挥了更重要的作用，其介导的信号途径可能包括：肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径、JNK途径、PI3K-PKB途径和cGMP-PKG途径。