内皮祖细胞移植治疗心血管疾病的新策略:基因修饰

1997年Asahara等首次从外周血CD34^＋细胞中分离到内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）后。围绕EPCs的研究便迅速展开和深入。近年来，基因修饰EPCs移植在以往EPCs移植治疗心血管疾病的研究取得一定成效的基础上得到发展，并初步展现了美好的应用前景。     

内皮祖细胞的体外培养

 目的 建立一个体外培养脐血来源内皮祖细胞（EPC）的培养体系。方法 脐带血经密度梯度离心获得单个核细胞,按本室已建立的培养体系细胞培养,免疫细胞化学和流式细胞术对培养7d后的细胞进行CD34、CD133、vWF、CD146及CD144鉴定。结果 接种后前5d为生长的潜伏期,细胞开始贴壁,无明显扩增。第6天平均每个视野下细胞数目为287+45;第9天细胞数为282+46;第12天开始,细胞进入对数生长期,细胞数为805+67（P<0.05）;第19天细胞继续增殖,细胞数为1115+182（P<0.05）;第23天时,细胞进入凋亡期,数量明显减少,为265+61（P<0.05）。vWF,CD146,CD144表达阳性。流式细胞术结果表明,梭形样细胞群体中,CD34阳性率为88.98%+5.15% (P<0.05),CD133阳性率为1.20%+1.44% (P<0.05)。结论 利用本实验室的培养体系成功培养出内皮祖细胞。     

外周血内皮祖细胞的诱导培养

目的 探索外周血内皮祖细胞的诱导培养方法。方法 用密度梯度离心分离健康志愿者外周血单个核细胞,EGM-2培养基重悬并在纤连蛋白包被的培养板中进行诱导培养,动态观察贴壁细胞生长状况,免疫荧光技术鉴定内皮祖细胞特性,流式细胞术检测细胞周期分布及其相关表面标志CD34、CD133、CD31、VEGFR2和CD14。结果 贴壁细胞呈细长条状分布,整体形态和生长密度均以第9天最佳,约占外周血单个核细胞的4.62%~5.47%;细胞停留在G0/G1期,增殖指数仅为（1.20±0.18）％;细胞自第5天起即可同时吞噬乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆类凝集素,Ⅷ因子相关抗原于第9天始呈阳性;表面标志CD34、CD133、CD31、VEGFR2和CD14分别为0.19%±0.06%、1.67%±0.52%、61.56%±5.57%、70.29%±7.37%和89.31%±4.11%,共同指示诱导所得细胞属于正在分化的内皮祖细胞。结论 在特定条件下可直接从外周血单个核细胞中诱导培养出内皮祖细胞。     

内皮祖细胞移植治疗糖尿病足的协同作用因素

背景：糖尿病足治疗已经走到瓶颈,自体骨髓/外周血内皮祖细胞移植是近年来治疗糖尿病足的新方式。 目的：针对血管内皮细胞生长因子受体2和整联蛋白在内皮祖细胞移植治疗糖尿病足过程中发挥作用的研究进展进行综述。 方法：第一作者应用计算机检索1998年1月至2012年12月PubMed数据库、中国期刊全文数据库有关内皮祖细胞治疗糖尿病足、整合素与血管内皮细胞生长因子受体2的相互作用以及整合素与血管内皮细胞生长因子受体2在内皮祖细胞增殖与血管新生作用方面的文章,英文检索词“diabetic foot,endothelial progenitor cells,VEGFR-2,integrin,synergistic effect”;中文检索词“糖尿病足,内皮祖细胞,血管内皮细胞生长因子受体2,整合素,协同作用”。共检索到98篇相关文献,排除重复研究,60篇文献符合纳入标准。 结果与结论：在糖尿病足治疗中,自体骨髓/外周血内皮祖细胞越来越受到重视,并逐渐成为最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点,内皮祖细胞移植已经逐渐发展成为糖尿病足治疗的新模式。血管内皮细胞生长因子受体2和整合素在糖尿病足治疗的血管生成中可能发挥了协同作用,但仍有许多机制还不清楚,要彻底明确整合素和血管内皮细胞生长因子的作用机制尚需进一步研究。     

内皮祖细胞与氧化应激

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是成熟内皮细胞的前体细胞,参与损伤组织的血管新生和再内皮化。研究表明,氧化应激能引起EPCs的数量减少和功能减弱。虽然EPCs存在抗氧化酶系统,但是当细胞正常的氧化还原稳态失衡时,活性氧过度产生而聚积,引起氧化应激,导致细胞的衰老或凋亡。     

内皮祖细胞与雌激素

背景：研究发现雌激素对血管内皮具有明显的保护作用,而内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞参与内皮的修复。 目的：总结内皮祖细胞生物特点及雌激素对内皮祖细胞作用的研究进展。 方法：应用计算机检索PubMed数据库及CNKI数据库,在标题和摘要中以“内皮祖细胞,雌激素”或“Endothelial progenitor cells,estrogen”为检索词进行检索。选择与内皮祖细胞生物学特点及雌激素对其作用研究相关的文献。 结果与结论：内皮祖细胞存在于骨髓和外周血中,是具有增殖、迁移、黏附能力并分化为血管内皮细胞潜能的原始细胞,可作为未来治疗心血管疾病的重要的靶点。雌激素对内皮祖细胞有保护效应,能增强内皮祖细胞增殖、迁移、黏附等生物活性,同时还能延迟内皮祖细胞衰老、拮抗其凋亡。但雌激素影响内皮祖细胞生物活性的具体靶点及机制尚有待进一步研究。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定

背景:当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞。目的:通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础。方法:绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分子CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-lectin和DiI标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能。结果与结论:绵羊骨髓单个核细胞原代培养2d细胞开始贴壁,7d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3～5d形成为典型的铺路石样,传代后第7d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%;免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达。细胞能同时吞噬FITC-labeledBS-1-lectin,DiI-ac-LDL阳性率达85.3%。证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞。     

内皮祖细胞移植对肺损伤炎症状态的影响

背景：内皮祖细胞在维持内皮系统功能及血管损伤后的修复中起重要作用,已广泛应用到心血管、下肢缺血、血管修复等多种疾病,但在炎症疾病及肺损伤中的研究较少。 目的：观察内皮祖细胞移植对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征肿瘤坏死因子α及白细胞介素10的影响,探讨细胞移植能否改善急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的炎症状态。 方法：同遗传背景SD大鼠30只随机均分为正常对照组、肺损伤组、细胞移植组。采用密度梯度离心法分离、培养SD大鼠的骨髓内皮祖细胞。肺损伤组、细胞移植组大鼠经尾静脉注射脂多糖建立急性肺损伤模型;正常对照组仅给予等量的磷酸盐缓冲溶液。造模半小时后,正常对照组、细胞移植组大鼠经尾静脉注入内皮祖细胞悬液;肺损伤组大鼠同法注入等量的磷酸盐缓冲溶液。 结果与结论：与肺损伤组相比,细胞移植组中白细胞介素10的水平显著增加(P < 0.001),肿瘤坏死因子α的表达下调,但差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植促进白细胞介素10的表达,下调肿瘤坏死因子α的表达,能改善损伤肺组织的炎症状态。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。 目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。 方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。 结果与结论：培养前4 d细胞增殖不明显,第5~10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133+ 细胞占19.2%,CD34+ 细胞占28.7%,CD34+/CD133+ 细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。 关键词：内皮祖细胞;细胞分离;细胞培养;骨髓;细胞鉴定 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.006     

内皮祖细胞移植对血管内膜修复的影响

目的： 从脾源性单个核细胞中分离并扩增血管内皮祖细胞（EPCs）,研究EPCs移植对血管损伤后内膜修复的影响。 方法: 大鼠脾源性单个核细胞贴壁培养法定向扩增EPCs，检测其内皮细胞特性。荧光标记EPCs从尾静脉移植到颈动脉内皮损伤的大鼠体内。 结果: 脾源性单个核细胞体外可诱导出内皮祖细胞，表现为表达内皮细胞特异性标志。移植后，EPCs可归巢至血管损伤部位。EPCs移植组在球囊损伤2周后血管新生内膜明显减少，血管腔狭窄程度显著减轻。EPCs移植组新生内膜/中膜比值显著低于单纯球囊损伤组及M199组(0.82±0.09 vs 1.52±0.21, 1.48±0.19,P＜0.01)。EPCs移植组PCNA 阳性表达细胞明显少于单纯球囊损伤组及M199组（19.25±3.96 vs 31.42±5.23, 29.37±3.16, P＜0.05）。 结论: EPCs能有效移植到内皮损伤血管段，参与损伤血管的内膜修复过程。     

内皮祖细胞与氧化应激研究进展

背景：内皮祖细胞是外周血中存在的一种干/祖细胞,是成熟内皮细胞的前体细胞,其与氧化应激的关系越来越受到人们的关注,而且国内外研究正日趋增多。 目的：对国内外内皮祖细胞与氧化应激关系的现状及新进展作一综述。 方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1997-01/2010-05关于内皮祖细胞与氧化应激的文章,在标题和摘要中以“内皮祖细胞,氧化应激”或“endothelial progenitor cells ,oxidative stress”为检索词进行检索。选择文章内容与内皮祖细胞与氧化应激有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到212篇文献,最终选择有代表性的34篇文献进行综述。 结果与结论：内皮祖细胞与氧化应激关系密切,虽然内皮祖细胞具有比成熟内皮细胞更强的抗氧化能力,但在长期氧化应激存在的情况下,氧化应激通过减弱其抗氧化酶的表达,增加氧化酶的表达而促进内皮祖细胞的凋亡而影响其功能及数量,故氧化应激是导致内皮祖细胞数量改变及功能受损的影响因素之一,而通过他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂/受体拮抗剂及过氧化物酶体激动剂的干预可改善内皮祖细胞的氧化应激状态,保护其功能。     

内皮祖细胞与缺血性脑卒中

背景:内皮祖细胞不仅能够早期预测血管损伤的程度,而且具有修复损伤的内皮细胞、促进新生血管形成管腔结构、参与神经再生的功能。内皮细胞移植已逐渐应用于血管相关性疾病的治疗。目的:文章综述了内皮祖细胞的生物学特性及在缺血性脑卒中领域的最新研究进展,为其临床应用提供理论支持。方法:以endothelial progenitor cells;ischemic infarction;为检索词检索Medline、HighWire Press数据库(2000-01/2009-12)。纳入与血管新生、内皮和神经再生密切相关的研究,排除内容陈旧、重复性及缺乏可信度文章。结果与结论:计算机初检得到126篇文献,根据纳入排除标准,对其中28篇文献进行分析。内皮祖细胞具有修复损伤的内皮细胞、延缓动脉粥样硬化进展、促进缺血组织新生血管形成等功能,它参与缺血性脑卒中后血管新生,防治支架术后血栓形成及再狭窄,预测脑缺血的发生及预后,在防治缺血性脑卒中方面具有广泛的应用前景。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。 目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。 方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3 d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景：传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。 目的：利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。 方法：采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。 结果与结论：培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P < 0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率> 80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景：内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。 目的：研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6 d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。  结果与结论：从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P < 0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。 目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。 方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。 结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

内皮祖细胞与肿瘤血管新生

血管内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞,特异性表达CD34,CD133和VEGFR-2,具有向血管内皮细胞分化的潜能。EPCs主要位于骨髓和外周血。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生。肿瘤细胞可合成和释放多种细胞因子,在不同因子的趋化作用下EPCs从骨髓动员至外周血循环,然后迁移和定居到肿瘤组织,经细胞因子诱导分化为成熟内皮细胞,参与肿瘤血管新生。VEGF/VEGFR-2信号途径在EPCs参与的肿瘤血管新生方面起重要作用。     

内皮祖细胞在肺动脉高压中的研究进展

肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是指在海平面静息状态下平均肺动脉压(mean pulmonaryarterial pressure,mPAP)≥20 mmHg,肺血管阻力(pulmonaryvascular resistance,PVR)≥3 Wood units 的一种疾病或病理生理综...     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。 目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。 方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。 结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

小型猪外周血内皮祖细胞的体外培养与分化研究

目的：研究小型猪外周血内皮祖细胞（EPC）的体外分离和定向分化、扩增培养方法，为EPC移植应用于临床提供实验依据。 方法： 密度梯度离心法从小型猪200 mL新鲜全血中分离单个核细胞，用含血管内皮生长因子等各种添加剂的内皮细胞系列专用培养液，分别在包被与不包被的培养皿中进行贴壁培养，诱导其向内皮细胞分化，观察经过不同时间培养后的细胞生长情况并进行诱导分化后的生物学鉴定，包括细胞表型鉴定、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）摄取试验、超微结构鉴定、体外血管生成实验。 结果： 包被了贴壁因子的培养皿细胞贴壁及增殖均多于未包被组。前者第3-4 d可观察到梭形贴壁细胞，10 d后出现多个细胞簇，14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构，原代细胞培养21 d左右接近融合并且呈典型的鹅卵石样排列。第7-14 d有大于98%的细胞Flk-1、vWF、CD31表达阳性，CD34+细胞为（26.01±2.82）％，有大于95%的细胞DiI-acLDL摄取试验阳性，透射电镜可见特征性的Weible-Palade小体存在，在血管生成实验中，血管内皮生长因子显著促进EPC形成小管的数量与复杂程度，呈一定的量效关系。 结论： 密度梯度离心法结合贴壁筛选培养法可以用于体外分离外周血中EPC进行实验研究，EPC在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮细胞，贴壁因子、血管内皮生长因子等对于体外培养EPC有很重要的作用。