人类肥胖相关新基因LYRM1原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人类肥胖相关新基因LYRM1原核表达载体,并获取LYRM1重组蛋白。方法采用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中扩增出LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代板乳糖苷(IPTG)诱导LYRM1融合蛋白的表达,利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)鉴定其表达。结果PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确。LYRM1基因在原核细胞中成功表达,经SDS-PAGE鉴定融合蛋白相对分子质量约为40000,主要以不可溶的包涵体形式存在于菌体沉淀中,Western blot分析表明融合蛋白具有免疫原性。结论成功扩增和克隆了人类肥胖相关新基因LYRM1,并通过构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大鼠肺表面活性蛋白C基因的克隆及原核表达

目的构建高氧下早产大鼠肺表面活性蛋白C基因原核表达质粒,实现其在大肠杆菌中的表达。方法孕21 d SD早产大鼠,生后12 h暴露于85%高氧中,7 d后处死,取肺组织,提取RNA,并合成cDNA,进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,经过酶切和测序验证,成功构建原核表达载体pET-28a(+)-sp-c,重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析检测表达产物。结果经酶切和测序验证,成功构建pET-28a(+)-sp-c质粒,高效表达出相对分子质量21 000的融合蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达SP-C重组融合蛋白,有助于研究SP-C蛋白与内质网之间的作用机制、SP-C错折叠蛋白在肺上皮A549细胞中的表达以及对AECⅡs增殖、分化及凋亡的影响。     

人结核杆菌HSP70原核表达质粒的构建及其抗肿瘤效应

目的构建可在大肠杆菌中表达编码人结核杆菌(TB)热休克蛋白70(HSP70)基因的表达质粒,并经纯化后研究重组蛋白rHSP70抗肿瘤效应。方法采用基因工程技术将HSP70基因经PCR及末端修饰后装入大肠杆菌质粒pRSET-B中,构建成新的重组质粒pMT70-3。诱导表达纯化后经Western-blot、抗原肽结合试验、native-page鉴定,在有ADP、MgCl2存在时利用重组人 TB的HSP70与小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210的上清于37℃温育形成HSP70-肿瘤抗原肽复合物,以此作为抗原进行体内肿瘤免疫保护试验。结果 HSP70基因的表达质粒构建成功,其产物人TB rHSP70经纯化后具有生物活性。实验动物的腹水量较对照组下降,表明该复合物可引起一定的免疫保护反应(与对照组比较P<0．05)。结论人TB rHSP70-肿瘤抗原肽复合物免疫刺激后可使小鼠产生针对同种肿瘤的强烈免疫作用,与其剂量有一定的相关性。人TB HSP70不仅可起到免疫佐剂的作用,且肿瘤抗原肽复合物也起到一定的抗肿瘤作用。     

幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)临床儿童分离株尿素酶B(UreB)基因入pGEX-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法根据GenBank中HpUreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoRI及NotI酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1710bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1UreB序列已登录GenBank(登录号:FJ455126)。结论从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreBHp口服疫苗研制奠定了基础。     

叶酸结合蛋白1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1.叶酸结合蛋白1(Folbp1)基因真核表达载体,检测其在肺腺癌A549细胞中的表达.方法 采用反转录.PCR技术从肺腺癌 A549 细胞中扩增Folbp1 基因的完整编码框,将其克隆到真核表达载体 pcDNATM 3.1/myc.His B,脂质体转染肺腺癌 A549细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的肺腺癌 A549细胞株,并利用Western blot法鉴定其表达.结果 PCR扩增Folbp1基因全长编码区,电泳显示其分子大小与823 bp预期值一致;连接产物pMD.Folbp1转化感受态细菌,经氨苄西林筛选,提取质粒鉴定表明插入pMD.18T载体的目的 片段大小和方向正确;重组质粒扩增Folbp1 基因连入pcDNATM 3.1/myc.His B载体,酶切鉴定显示切出约5.1 kb符合载体大小的条带及符合插入片段大小的特异条带;转染pcDNA 3.1.Folbp1重组质粒的肺腺癌 A549细胞株经抗生素G418筛选,Western blot分析显示与预期大小一致的特异性条带.结论 pcDNA 3.1.Folbp1真核表达载体构建成功,并在肺腺癌 A549细胞内过表达,这将为研究Folbp1基因的功能及其肺发育中奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）临床儿童分离株尿素酶B（UreB）基因入Pgex-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法：根据GenBank中Hp UreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoR I及Not I酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果：以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1 710 bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1 UreB序列已登录GenBank（登录号：FJ455126）。结论：从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreB Hp口服疫苗研制奠定了基础。［中国当代儿科杂志,2009,11（11）：877-880］     

人肺表面活性物质相关蛋白A1基因在大肠杆菌中的表达及产物的分离纯化

目的 研究人肺表面活性物质相关蛋白A1（SP－A1）在大肠杆菌中的表达、产物纯化及免疫原性。方法 将人SP－A1基因克隆至表达载体pGEX-2T上,分别转化至大肠杆菌JM101、JM105、JM109、 XL1－blue和BL21（DE3）等不同宿主,并在不同温度中的表达,采用包涵体纯化方法及亲和层析法纯化目的蛋白,用ELISA及Westert blot初步分析SP－A1蛋白的免疫原性,融合蛋白质经凝血酶酶切分析。结果 SP－A1基因在前4种宿中表达有完整蛋白质和不完整蛋白质,目的蛋白质分别占总蛋白的6.7%、9.3%、14.8%;于28℃时,该基因在BL21（DE3）缩主中表达产物均为完整蛋白质,占总蛋白质的10%。经包涵体纯化和Glutathione Sep harose 4B亲和层析纯化,可获得纯度达95％以上的纯化蛋白。目的蛋白可被抗SP－A多克隆抗体特异识别,凝血酶作用后可切出相对分子质量为26000的目的蛋白片段。结论 人组织特异性蛋白质SP－A1可在大肠杆菌中表达,表达产物具有良好的免疫原性。     

M122蛋白与宿主因子Myst4的相互作用位点

目的 明确M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的位点.方法 以诱饵载体pGBKT7-M122为模板,采用PCR方法扩增不同长度大小的M122基因片段,并将其分别插入至pMD-T simple载体,构建含有不同长度M122基因片段的重组质粒.将构建成功的各个重组质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的重组质粒采用同样的内切酶进行双酶切,凝胶回收试剂盒回收不同长度大小的M122基因片段,并将其分别亚克隆至pGBKT7-BD载体构建含有不同长度M122基因片段的诱饵质粒.将构建成功的各个诱饵质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的各个诱饵质粒分别与pGADT7 -Myst4质粒共同转化至酵母菌株AH109感受态细胞,转化后的酵母细胞分别涂板于营养缺陷培养基SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板.M122与宿主因子Myst4相互作用的位点通过营养缺陷筛选确定.结果 成功扩增了编码不同M122蛋白突变体的基因片段,并将其正确插入诱饵载体,构建了含有不同长度大小M122基因片段的诱饵质粒;通过酵母双杂交筛选明确了M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的结合位点位于M122蛋白的1～ 148氨基酸.结论 M122蛋白的1～ 148氨基酸是其与宿主因子Myst4相互作用所必需的,为研究M122蛋白在MCMV致神经系统损伤的分子机制中的作用提供了实验基础.     

人肺表面活性相关蛋白A1在甲醇酵母的胞内表达

目的：研究人肺表面活性相关蛋白A1(SP-A1)在甲醇酵母中的胞内表达。方法：将编码正常人肺表面活性相关蛋白A1基因的cDNA克隆至甲醇酵母的胞内，表达载体pPIC3.5K，构建了重组质粒pPIC3.5K/SPA1，电穿孔方法转化至酵母宿主菌GS115和KM71，用PCR方法筛选阳性转化子，并用斑点印迹法、G418方法筛选多拷贝转化子，经甲醇诱导表达，SDS-PAGE和Western印迹法鉴定表达产物。结果：SP-A1基因在甲醇酵母中成功的表达了蛋白质，SDS-PAGE分析证实目的蛋白分子量为32 kD，可被SP-A多克隆抗体特异识别。结论：人组织特异SP-A1蛋白可在甲醇酵母中高效表达，表达产物具有免疫源性。     

人巨细胞病毒UL140基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的 研究人巨细胞病毒HCMV-UL140基因在临床低传代分离株中的多态性及其与：病性的关系。方法 对40株HCMV临床低传代分离株进行UL140基因全序列的PCR扩增，对121进行了测序及结果分析。结果 40株HCMV-UL140基因PCR扩增均阳性。测序的12株HCMV-UL140开放阅读框架(ORF)均在Toledo株ULl40-ORF的第174位核苷酸处，插入一个胞嘧啶核苷酸．造成移码突变。与Toledo株相比，临床分离株新增了SCAMP磷酸化SPS和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化KP两种重要功能位点，且其所位于的氨基酸位点可能是UL140蛋白的蛋白质作用位点。结论 临床分离株UL140基因的ORF较Toledo株多出231个核苷酸，故两者的核苷酸及其编码产物氨基酸序列明显不同。临床分离株存在SPS及CKP两种新的重要功能位点，可能在HCMV-UL140编码蛋白的生物学功能方面起重要作用。     

人硫氧还蛋白1多克隆抗体制备及对内毒素血症新生大鼠的保护作用

目的 克隆人硫氧还蛋白1(hTrx-1)基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达,制备其多克隆抗体.初步探讨hTrx-1对内毒素血症新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的保护作用.方法 从人胎肝细胞中用RT-PCR的方法得到了hTrx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌诱导表达并纯化,纯化的蛋白免疫...     

人巨细胞病毒pp65基因疫苗的研制

目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染的效果。方法应用聚合酶链式反应（PCR）扩增HCMVpp65基因全长、巨细胞病毒（CMV）启动子的上下游序列,转化至质粒并载体,测序;合成分泌肽基因,构建自制的含CMV启动子、pp65基因和分泌肽基因的pcDNA5.0转染载体,即HCMVpp65基因疫苗。将该载体疫苗通过脂质转染法转至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,Western点杂交检测CHO细胞上清中pp65蛋白。结果克隆pp65基因全长测序结果与HCMVAD169株上的pp65标准序列比较：一致性为99.99%。构建了含有分泌肽、CMV启动子（含有增强子和内含子）和pp65全长pcDNA5.0的转染载体,即HCMV基因疫苗。转染至CHO细胞,其上清培养提取物Western点杂交阳性。结论含有分泌肽、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNA5.0真核载体即粗制的HCMV基因疫苗可成功构建。     

人细小病毒B19 VP1独特区基因变异的研究

目的：获取人细小病毒B19(HPV B19)VP1独特区基因,并进行序列测定及变异分析,为研制诊断试剂及预防疫苗创造条件。方法：应用聚合酶链反应（PCR）技术从1例急性特发性血小板减少性紫癜患儿的血清中扩增HPV B 19VP1独特区基因片段,将其克隆至pGEM-T easy载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测定目的基因的序列。结果：成功地扩增到HPV B19 VP1独特区全长基因,长度为705个核苷酸,测定结果与Genbank中Gallinella G和Venturoli S所发表的HPV B19 VP1独特区全长基因序列比较,有2处核苷酸发生突变,但所编码的氨基酸均未发生变化。结论：（1）HPV B19 VP1独特区有基因变异;（2）构建了HPV B19 VP1独特区基因的重组质粒,所获实验结果为深入研究奠定了基础。     

北京地区人群中人Boca病毒血清抗体的分析

目的 通过对血清中人Boca病毒(HBoV)主要衣壳蛋白VP2特异性IgG抗体进行检测,初步了解北京地区人群中这种新发现的病毒的感染状况.方法 以大肠杆菌表达的HBoV主要衣壳蛋白VP2为抗原,应用Western-blot方法,对1996年4月至1997年3月取自首都儿科研究所附属儿童医院健康查体者及北京宣武医院非呼吸道感染患者的血清标本共677份进行HBoV VP2蛋白特异性IgG抗体检测.设抗组氨酸抗体及兔抗HBoV-VP2多肽特异性免疫血清为阳性血清对照.结果 (1)677份血清标本中,抗HBoV VP2蛋白的IgG抗体阳性400份,总检出率为59.1%.(2)被检对象中,＜1个月的婴儿抗体阳性率为45.3%,1个月～的婴儿抗体阳性率为41.4%,2个月～的婴儿抗体阳性率最低(31.3%),6个月～至7岁龄抗体阳性检出率在45.6%～69.7%,7岁后直至40岁,抗体阳性检出率维持在70%左右;50岁后则为61.8%～62.8%.结论 早在1996年北京地区的人群中就有59.1%曾经感染过HBoV,说明这种病毒是一种新发现的病毒而不是新出现的病毒,北京地区人群中该病毒的感染较常见.6个月龄以前的婴儿为易感人群.     

北方秋冬型恙虫病新疫区儿童恙虫病临床特点及其流行因素

目的 探讨北方秋冬型恙虫病新疫区儿童秋冬型恙虫病临床特点及流行因素.方法 1993年9月至2004年1月在秋冬型恙虫病新疫区山东费县5所乡镇医院共收治儿童恙虫病患儿56例,对所获临床资料统计分析,同时调查当地疫源地,并进行恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)分离与鉴定.结果 男性患儿多见(占82%);均为农村患儿,都有野外暴露史;9～11月为发病季节,高峰在10月中、下旬;有特异性皮肤焦痂或溃疡者占96%(54/56),100%患儿高热,98%的患儿有皮疹(55/56),86%的患儿有淋巴结肿大(48/56);间接免疫荧光法检测抗体阳性占94.12%;常伴有脏器损害(75%).小盾纤恙螨是该地恙虫病主要传播媒介,黑线姬鼠是当地野外Ot最重要的宿主.结论 儿童秋冬型恙虫病是北方恙虫病新疫区一种常见的自然疫源性疾病,流行区野外暴露史、皮肤特异性焦痂或溃疡、间接免疫荧光法检测抗体阳性是该病重要诊断依据.     

Studies on Adherence and Outer Membrane Protein of Enteropathogenic Escherichiai coli 0127: H6 and Their Related Plasmids

ABSTRACT. The following characteristics were found in 20 epidemic strains of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) 0127: H6 isolated from an outbreak of neonatal diarrhea: 1) Absent Vero toxin production; 2) No potential for invasiveness; 3) Possession of 1.5 and 60 Md plasmid identical restriction digest and outer membrane protein (OMP) patterns; 4) Ability of localized adherence to HEp-2, HeLa and FL cells; 5) Capability to cause diarrhea in rabbits with destruction of the ileal microvilli at the areas of bacterial adherence. After elimination of the 60 Md plasmid from EPEC 0127: H6 the 45 and 82 Kd OMPs of the parent strain were lost. These plasmid-cured strains became non-adherent to HEp-2, HeLa and FL cells, and unable to cause diarrhea in rabbits. These results suggest that the pathogenic mechanism of EPEC 0127: H6 induced diarrhea may be related to the genes on a 60 Md plasmid expressed as 45 and 82 Kd OMPs which cause localized adherence to epithelial cells and destruction of ileal microvilli. This damage leads to a marked reduction in absorptive surface area, resulting in diarrhea.