大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

目的:探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell,MSC) 分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性.方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达.结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征.MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12.结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞.     

模拟角膜缘干细胞微环境诱导人多潜能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究

目的：探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法：体外建立hiPSCs细胞系，利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境，添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542)，诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化。采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物 CK3和CK12，角膜上皮细胞前体CK15，角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达。结果：hiPSCs体外培养增殖活跃，免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性。采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养，免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性，角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性； 在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542，免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达，且随分化时间延长表达比例增高。结论：模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4，可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化。     

人角膜基质细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的初步研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）体外分化为角膜上皮细胞的可行性.方法 实验研究.分别取第3代人MSC和自行培养的第3代人角膜基质细胞共同培养1周,实验组在Transwell共培养体系中培养,对照组不放置Transwell小室培养.1周后,观察实验组和对照组中人MSC光镜特征、间接免疫细胞化学染色和电镜结构,对被诱导分化的细胞进行综合鉴别.结果 第3代人MSC和人角膜基质细胞在体外培养条件下均能够较快贴壁生长.两种细胞共同培养1周后,可见部分细胞形态上呈上皮细胞特征,单克隆抗体AE1染色呈阳性,电镜下可见微绒毛、桥粒和张力丝等典型上皮细胞结构特征.结论 体外培养的人MSC在人角膜基质细胞的诱导下可能会分化为人角膜上皮样细胞.     

种植人骨髓间充质干细胞的猪角膜板层移植治疗兔角膜损伤的初步研究

目的研究种植人骨髓间充质干细胞（MSCs）的猪角膜基质治疗兔角膜损伤的可能性。方法用全骨髓贴壁法分离纯化人MSCs并传代,流式细胞仪检测免疫表型及诱导成脂、成骨分化鉴定。12只新西兰白兔随机分为2组,实验组取第3代MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4 d后移植到广泛损伤的兔角膜上,对照组单纯移植去上皮猪角膜基质。术后2、4、8周,取各实验眼行组织学检查,观察移植的MSCs及猪角膜基质的存活、转归及移植局部的反应。免疫组织化学、免疫荧光染色检测移植后角膜上皮细胞角蛋白12的表达。结果培养获得的MSCs中CD29阳性者占95.97%,CD44阳性者占96.49%,CD90阳性者占92.79%,CD105阳性者占94.66%,CD34阳性者占0.59%,CD45阳性者占0.36%,符合MCSs的免疫表型,并可以诱导成脂及成骨分化。实验组MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,无排斥反应,角膜较对照组透明,新生血管少,而对照组在移植后发生排斥反应。实验组角膜免疫组织化学及免疫荧光染色均检测出CK12阳性细胞。结论种植MSCs的猪角膜基质移植到损伤兔角膜后可以存活,MSCs可以分化为角膜上皮样细胞,具有构建组织工程角膜的潜能。     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法

目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。     

人骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞缺损动物模型中的分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化为角膜上皮细胞的可塑性及可行性。方法20只日本大耳白兔随机分为对照组和实验组,每组10只,右眼为实验眼。实验组：将人MSCs接种在人羊膜上培养4d后移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型;对照组：仅采用羊膜移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型。分别于移植后第1、第2、第3、第4和第6周,摘取各组眼球,分别行HE和PAS染色、单克隆抗体AE1和PCNA染色、透射电镜和扫描电镜检查。结果人MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长,与羊膜共培养4d后,人MSCs贴附羊膜生长迅速,组织学特征无明显改变。羊膜负载人MSCs移植到兔角膜基质表面,角膜表层细胞PAS染色呈阴性,AE1和PCNA染色呈阳性,具有典型的上皮细胞形态;而对照组PAS染色呈阳性,AE1和PCNA染色呈阴性。超微结构观察可见,实验组电镜下可见微绒毛、桥粒和张力丝等典型上皮细胞结构,而对照组未见以上明显特征。结论羊膜负载人MSCs移植到兔眼表角膜基质后,MSCs能存活、增殖并向角膜上皮样细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的 应用猪板层角膜做载体将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)跨胚层诱导为上皮样细胞,甚至角膜上皮样细胞,初步探讨hMSC作为构建组织工程角膜种子细胞的可行性.方法 实验研究.用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化hMSC并传代,对体外培养的hMSC进行免疫表型鉴定.将传代后的hMSC接种于去上皮的猪角膜基质片前弹力层表面培养诱导分化,免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(CK12)以及角膜缘干细胞标记物ABCG2和CK19的表达.运用体外培养的方法使种植在前弹力层表面的细胞复层化.待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养.培养4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况.结果 获得的hMSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能.流式细胞仪示:培养的hMSC CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%.诱导4周后部分细胞表达CK12和CK19,不表达ABCG2.运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示可以形成1～2层的上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞.结论 在本实验的诱导条件下,hMSC可以分化为上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞,hMSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择.     

以不同性质羊膜为载体培养人角膜缘干细胞的生物学特性

目的:观察并比较在完整羊膜和去上皮层羊膜这两种不同性质的载体羊膜上培养的人角膜缘干细胞的生物学特性。方法:采用组织块培养法,将角膜缘组织块种植于完整羊膜(I组)和去上皮层羊膜(D组)上进行培养,并对细胞的生长特点,超微结构以及免疫荧光染色结果进行观察。结果:在这两种性质的羊膜上人角膜缘干细胞均可生长形成单层,扫描电镜观察见细胞之间存在细胞连接。免疫荧光细胞化学染色结果显示,I组细胞BrdU标记阳性率高于D组(I组vsD组,P<0.05),而对AE5和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的阳性率低于D组(I组vsD组,P<0.05),对增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达两组均较高。结论:人角膜缘干细胞均可在这两种性质的羊膜上生长,在去上皮羊膜上生长的干细胞有不同程度的分化,而完整羊膜能更好的维持干细胞特性。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向色素上皮样细胞分化的研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)向色素上皮样细胞诱导、分化的可行性,为视网膜移植提供种子细胞的来源.方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,HRPE)和 MSC,应用免疫细胞化学法检测CD34、CD44 和角蛋白的表达情况,确定2种细胞的来源;通过 Transwell 6孔板非接触共培养的方式,建立 HRPE 和 MSC 共培养体系,显微镜下观察人 MSC 的形态学变化;对于诱导后的 MSC 进行免疫细胞化学鉴定,确定角蛋白的表达情况.结果 MSC呈纤维样克隆样生长,人MSC的CD44(+),CD34(-);HRPE原代培养时细胞内布满色素颗粒,角蛋白表达(+).HRPE和MSC共培养体系中,部分长梭形的MSC逐渐变成多边形,细胞内出现典型的色素颗粒;分化的色素上皮样细胞角蛋白表达阳性.结论 MSC与HRPE在非接触共培养诱导方式下能分化成色素上皮样细胞;分化的细胞具有上皮细胞的特异性标志,诱导后的细胞是否具有HRPE的功能尚有待于进一步研究.     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

The Preliminary Experimental Study of Induced Differentiation of Embryonic Stem Cells into Corneal Epithelial Cells

Purpose: To study preliminarily induced differentiation of embryonic stem cells into corneal epithelial cells in vitro.Methods: Murine embryonic stem cells were co-cultured with Rabbit limbal corneal epithelial cells in Transwell system to induce differentiation. Mophological and immunohistochemical examination were implemented.Results: The induced cells from embryonic stem cells have an epithelial appearance. The cells formed a network and were confluent into film gradually after being co-cultured with rabbit limbal corneal epithelial cells for 24 ~ 96 hours. The cells ranged mosaic structure and localized together with clear rim. Most of the cells showed polygonal appearance. Transmission electron microscope showed lots of microvilli on the surface of induced cells and tight junctions between them. These epithelial-like cells expressed the corneal epithelial cell specific marker cytokeratin3/cytokeratin12. Conclusion: The potential mechanism of the differentiation of murine embryonic stem cel     

In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma

AIM:To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.METHODS: Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.RESULTS:HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.CONCLUSION: Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.     

体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

目的探索以人永生化角膜上皮细胞( immortalized human corneal epithelial cells,ihCEC) 培养液体外模拟角膜上皮细胞微环境,诱导人羊膜上皮细胞( human corneal epithe-lial cells,hAEC) 分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法取( 37 ± 1) 周剖宫产人羊膜组织,酶消化法提取 hAEC; 流式细胞仪测 CD29、CD90、CD105、CD34、HLA-DR 的表达。复苏培养 ihCEC,以 0 mg·L- 1、10 mg·L- 1、20 mg·L- 1、30 mg·L- 1、40 mg·L- 1丝裂霉素 37℃作用 2 h,吸去丝裂霉素,继续培养 72 h 后 CCK8 测吸光度并计算增殖抑制率。10 mg·L- 1、20 mg·L- 1丝裂霉素处理细胞后 12 h、24 h 收集细胞培养液培养 hAEC,CCK8 测吸光度绘制生长曲线; 收集 ihCEC 细胞培养液,制备条件培养基( CM) 培养 hAEC 10 d,倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光检测 CK12 的表达。结果 hAEC 可表达 CD29、CD90、D105,不表达 CD34、HLA-DR; 各浓度丝裂霉素组增殖抑制率分别为 10 mg·L- 1( 65. 48% ±1. 03) 、20 mg · L- 1( 77. 01% ± 0. 99) 、30 mg · L- 1( 75. 25% ± 0. 71) 、40 mg · L- 1( 76. 90% ±0. 97) ;20 mg·L- 1丝裂霉素培养 12 h 收集的细胞培养液对 hAEC 具有明显促增殖作用; 诱导分化后 hAEC 可表达 CK12。结论以 ihCEC 细胞培养液模拟的角膜上皮细胞微环境可诱导 hAEC 分化为角膜上皮样细胞。     

慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性,已有学者用其进行眼表重建,其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs,荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达,倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态,用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率,然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型,随机分为2组,实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料,对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料,每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球,荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达,用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达,以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似,流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高,为61．50％,与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明,组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光,免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色,细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿,荧光显微镜下未见荧光,且部分角膜组织有CK8、CKl8表达,无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层,可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的:了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡情况。方法:将培养的人RPE细胞置于含10mL/LO2、50mL/LCO2和940mL/LN2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1,3,6,12,24h,利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucle-otidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平。结果:常氧状态下RPE细胞生长良好,几乎没有凋亡(TUNEL法测凋亡指数为1.2)。缺氧条件下,RPE细胞发生了不同程度的凋亡,缺氧后3h凋亡水平达峰值(凋亡指数为34.43)。结论:缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡,提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生。     

胚胎干细胞定向诱导为结膜上皮样细胞的实验研究

目的：研究体外诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为结膜上皮细胞的可能性及条件，为构建组织工程化结膜提供新型的种子细胞奠定基础。方法：以人结膜上皮细胞作为诱导条件，采用分层共培养的方法诱导小鼠ESC，倒置相差显微镜观察共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞角蛋白3／12(CK3/K12)、角蛋白13(CKl3)、MUC4和MUC5AC的表达。结果：采用人结膜上皮细胞作为诱导条件，ESC在诱导72h后可见部分细胞显示典型上皮祥细胞形态，免疫组化检测CKl3、MUC4表达阳性，CK3/K12，MUC5AC表达阴性。结论：采用分层共培养的方法，用人结膜上皮细胞作诱导剂可以诱导小鼠ESC向结膜上皮样细胞分化。眼科学报2003；19：117-121