含有H5N1 NA基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的免疫效果研究

目的 考察含有禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)优化型NA基因的重组腺病毒在BALB/c小鼠体内的免疫效果,并筛选合适的免疫剂量.方法 重组病毒以肌内注射方式在第0周和第4周免疫BALB/c小鼠两次,低、中、高组的免疫剂量分别是10~5、10~7和10~9 TCID_(50)/次,第5周时分别使用神经氨酸酶活性抑制试验和EHSpot实验来检测和比较疫苗的体液和细胞免疫效果.结果 重组病毒免疫后的小鼠均可检测出针对NA抗原的特异性体液和细胞免疫反应,并且免疫效果与免疫剂量呈正相关,10~7 TCID_(50)/只/次是合适的免疫剂量.另外,从包含NA全长氨基酸残基的合成肽库中筛选到两个能够刺激BALB/c小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位,即NA_(109-124):CRTFFLTQGALLNDKH和NA_(182-199):AVAVLKYNGIITIKSW.结论 含有优化型NA基因的重组腺病毒疫苗能够诱导BALB/c小鼠同时产生NA抗原特异性的体液和细胞免疫反应,是较好的H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究.     

重组流感病毒H1N1活菌疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

目的获得两种流感病毒重组沙门氏菌X4550(asd-pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-NA)活菌疫苗,并对其免疫效果进行初步的研究。方法将本室已构建好的重组质粒pVAX1-HA及pVAX1-NA双酶切后得到HA、NA基因,将其克隆入asd-pVAX1构建重组的表达质粒。将重组质粒转染COS-7细胞,用免疫细胞化学方法鉴定重组质粒体外的表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,以2×109CFU/只的剂量三次口服免疫Balb/c小鼠。结果asd-pVAX1-HA和asd-pVAX1-NA均能在COS-7细胞中表达;免疫小鼠不仅可以检测到HA、NA特异性的血清IgG及IgA抗体;刺激黏膜免疫反应,产生sIgA抗体,而且能抵抗40LD50同型病毒滴鼻的攻击。结论H1N1流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌运送系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

禽流感 HA 基因密码子优化的 DNA 疫苗构建及其免疫原性的初步研究

 目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素（HA）DNA疫苗并研究其免疫原性。方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam 1203/04株HA（H5-VN HA）基因序列，对这些序列进行密码子优化处理，人工合成优化后的H5-VN HA基因。将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接，并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）信号肽取代H5-VN HA信号肽，构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒，命名为HA-VN.tPA（即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗）。以HA-VN.tPA转染293T细胞，应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达。以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫，用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生。结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因。蛋白质印迹法分析结果表明，HA-VN.tPA转染293T细胞后，细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达。ELISA分析结果表明，以HA-VN.tPA免疫3次后，实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体（血清中平台期抗体滴度达1:13 500）。结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA 基因DNA疫苗，该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体。     

应用果蝇S2细胞高效表达甲型H1N1流感病毒可溶性HA蛋白及其活性分析CSCD

目的应用果蝇s2细胞表达甲型H1Nl流感病毒可溶性HA蛋白,并评估其免疫活性。方法以甲型H1N1流感A／Shenzhen／7I／09病毒株作为模版,采用RT-PCR技术扩增HA基因,构建持续性表达载体pAC5．1-HA,协同筛选载体pCoblast共转染至s2细胞,通过Blasticindin抗生素筛选获得稳定转染的s2细胞株。利用WesternBlot技术鉴定细胞上清HA蛋白表达,使用Ni亲和柱纯化重组HA蛋白。使用HA免疫BALB／c小鼠3次,利用ELISA检测HA特异性抗体效价。结果成功克隆A／Shenzhen／7I／09HA基因,长度约1．7×10^3bp。将HA基因克隆入pAC5．1-V5／His载体,经过转染、抗生素筛选后获得稳定表达HA的s2细胞株,目的蛋白以分泌形式表达于上清,相对分子质量约75×10^3D。免疫小鼠后可诱导机体产生抗HA特异性抗体,免疫后10d、30d效价分别为1：1280、1：5120。结论获得可溶性表达的HA蛋白,并具有良好的免疫活性,为后期流感免疫诊断试剂的研制、亚单位疫苗的开发、单克隆抗体的制备奠定了基础。     

表达HIV-1 B亚型env基因的质粒DNA及腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

目的 构建表达中国B亚型HIV-1流行株env基因的DNA及重组腺病毒载体疫苗,将其用于预防或治疗HIV感染.方法 构建质粒DNA疫苗pVR-gp160及重组腺病毒载体疫苗rAdV-gp160.将这两种疫苗以不同的方式免疫BALB/c小鼠,分别采用ELISPOT方法 和ELISA方法 检测免疫小鼠中HIV-1 Gp120特异性细胞免疫反应及抗体反应.结果 DNA疫苗单独免疫及DNA疫苗初免/腺病毒疫苗加强免疫的联合免疫方案皆可诱导较高水平的Gp120特异性细胞免疫反应;而在体液免疫方面,各实验组产生的Gp120特异性抗体水平都较低.结论 所构建的DNA疫苗及rAdV疫苗能有效表达Gp160蛋白,并可有效激活机体的细胞免疫反应.     

流感病毒NA-C3d融合基因在非复制型重组腺病毒中的表达及其免疫效果的研究

目的 构建表达融合基因NA-C3d的非复制型重组腺病毒并研究其免疫效果.方法 将NA-C3d融合基因克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV,与腺病毒DNA共转化E.coli BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒并检测其免疫效果.结果 NA-C3d经PCR证实整合至腺病毒基因组中;重组病毒感染293细胞中经Wstern Bot检测到融合蛋白;重组病毒经滴鼻途径免疫小鼠,2次免疫后产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶1000和1:100000;经小剂量攻毒实验显示重组腺病毒保护率为100％.结论 成功构建表达NA-C3d的非复制型重组腺病毒,该病毒可诱导较好的免疫效果.     

H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究

目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM。用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。采用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。     

HIV-1C亚型nef基因构建的DNA质粒诱导小鼠免疫反应的研究

目的构建表达中国流行株HIV-1C亚型调控nef基因的重组质粒pVAX-nef，并免疫BALB／c小鼠，观察其免疫效果，为探索新型HIV DNA疫苗提供数据。方法利用分子生物学技术，将nef基因克隆到pVAX，并在体外进行表达与鉴定。以纯化的Nef蛋白作为包被抗原，用ELISA检测其体液免疫反应，用ELISPOT检测其细胞免疫反应。结果重组质粒pVAX-nef成功构建。接种小鼠后2周，ELISPOT结果显示产生了针对HIV特异的CD4和CD8细胞抗原表位的免疫应答，且与免疫剂量存在一定的正相关性。ELISA实验诱导产生了抗HIV-1特异性抗体，其中40μg免疫组诱导的抗体水平最高。结论重组质粒pVAX-nef免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

含密码子优化型HPV16 L1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

目的 构建含密码子优化型HPV16L1基因的重组腺病毒,对其经不同接种途径所诱导的系统性及黏膜免疫效果进行研究.方法 使用Admax系统包装重组腺病毒,纯化的腺病毒以不同方式免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA及体外中和实验检测免疫小鼠血清及阴道分泌物中的特异性抗体.结果 重组腺病毒滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应,重组腺病毒肌注免疫仅能诱导系统性免疫反应,而阴道黏膜接种不能有效诱导系统性及黏膜免疫反应.结论 成功构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,重组腺病毒肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应.     

B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株HA基因重组3型腺病毒的构建

目的:构建包含有B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株血凝素(HA)基因的重组3型腺病毒.方法:用PCR方法扩增得到HA基因, 酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK-CMV, 构建重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 然后在大肠杆菌BJ5183内进行经 Not I和 Eco R V线性化的pSK-CMV-HA和经 Rsr Ⅱ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组, AsiS I酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3-HA后脂质体法转染HEp-2细胞, 进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 并且通过病变观察、扫描电镜、 RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测.结果:将HA基因克隆入pSK-CMV获得重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 线性化的pSK-CMV-HA与pBRAdV3△E3同源重组后获得pBRAdV3△E3-HA, 线性化的pBRAdV3△E3-HA转染HEp-2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达.结论:成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 为B型流感病毒-3型腺病毒二联活苗的研究提供了依据.     

人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达

目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统,为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板,PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中,构建重组质粒pQE80-L/M1,转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白,能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合,且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。     

遗传重配获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以传统遗传重配技术选育HSN1流感病毒Veto细胞适应株,制备Vero细胞H5N1流感疫苗。方法以流感病毒Vero细胞适应株A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）为母株与反向遗传学技术改造的禽流感病毒疫苗株A／Anhui／1／2005（H5N1）共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用羊抗A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）抗体筛选,血抑试验和基因测序鉴定病毒型别,并进行重配株的其他相关生物学试验。结果获得了1株在Vero细胞高产的H5N1流感病毒,重配前后的单价灭活疫苗免疫小鼠抗体血清效价差异无统计学意义（F=0．857,P〉0．05）。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株。     

无锡市流感病毒抗体水平调查

目的调查无锡市人群中甲型、乙型流感病毒抗体水平和新甲型H1N1流感病毒传人前后人群中抗体水平,并对新甲型H1N1流感病毒传人1年后自然人群中成人抗体水平与接种新甲型H1N1流感疫苗后1年的成人抗体水平进行比较。方法收集2008年9月至2009年5月、2010年9月至2011年1月无锡市不同年龄段人群血清和接种新甲型HIN1流感疫苗1年的成人血清,用血凝抑制（HI）试验测定抗体,并比较不同时间段各人群中的流感抗体阳性率、保护率和几何平均滴度（GMT）。结果新甲型H1N1流感病毒传入前,无锡市自然人群的HI抗体阳性率为2．86％（4／140）,保护率为0．71％（1／140）,GMT为5．23。新甲型H1N1流感病毒传入1年后,自然人群的HI抗体阳性率为66．33％,保护率为37．76％、GMT为19．17;其中成人HI抗体阳性率、保护率和GMT分别为50．00％、19．44％和13．09。接种新甲型H1N1流感疫苗的成人1年后HI抗体阳性率、保护率和GMT分别为61．36％、22．73％和14．14,与自然人群中成人在流感病毒传入1年后的抗体水平差异无统计学意义（P均〉0．05）。无锡市人群中甲型与乙型流感病毒HI抗体水平分别为：H1N1病毒抗体阳性率为55．00％,保护率为35．00％,GMT16．90;H3N2抗体阳性率为86．40％,保护率为84．30％,GMT为58．56。结论新甲型H1N1流感病毒传入无锡市1年后,自然人群中新甲型H1N1流感病毒抗体阳性率、保护率和GMT均已达到季节性流感抗体水平。同时人群中已有一定水平的甲型、乙型流感病毒抗体,近期不会发生较大的季节性流感疫情。     

2004-2008年我国流行的A型流感病毒抗原性及HA1基因特性的研究

目的 了解我国2004-2008年A(H1N1、H3N2)型流感病毒流行情况、抗原性和基因特性变异关系,了解疫苗株与我国流行株之间抗原性变化情况.方法 选择2004年以来我国分离的A(H1N1、H3N2)型流感病毒进行抗原性及HA1区基因序列,通过比对HA1蛋白位点变异情况,分析我国流感病毒抗原性及基因特性变化情况.结果 A(H1N1)亚型流感毒株抗原性2004-2007年分离的A(H1N1)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)类似;2008年我国流行的A(H1N1)亚型毒株的抗原性与2008-2009年北半球的流感疫苗株A/Brisben/59/2007(H1N1)类似.2004-2005年分离的A(H3N2)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/Fujian/411/12002(H3N2)比较发生了变异;2006-2007年我国流行的H3N2毒株与A/Wiscansin/67/2006(H3N2)类似,2008年我国流行的H3N2毒株与疫苗株A/Brisben/10/2006(H3N2)类似.结论 2004-2008年我国流行的A(H1N1、H3N2)亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变.     

2009-2010年山西省流感／甲型H1N1流感的病原学监测分析

目的分析掌握山西省2009--2010年流感／甲型H1N1流感的流行特征,为预测和防控流感／甲型H1N1流感流行提供科学依据。方法对哨点医院和集体发热疫情进行监测采样,采用病毒核酸检测法和细胞培养法分离鉴定流感／甲型H1N1流感病毒,并对2009年5月至2010年4月山西省录入“中国流感监测信息系统”的流感样病例监测报告数据及其样本病原学监测数据进行统计分析。结果山西省全年均有流感病毒活动,2009年流行优势毒株为甲型H1N1流感病毒,流行最高峰在11月（阳性率为58．1％,甲型H1N1占88．1％）,主要导致59岁以下人群发病,其中5-24岁年龄组阳性率较高,进入2010年后乙型（Victoria系）流感病毒的活动有所增加,成为流行株。结论流感样病例监测和病原学监测,可以及时反映流感活动状况,对于掌握该省流感／甲型H1N1流感流行规律有着重要意义。     

H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.     

抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY防治小鼠流感病毒感染的实验研究

目的:探讨抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY(Immunoglobulin Yolk)预防及治疗流感病毒感染小鼠的作用。方法:建立A/fm/1/47(H1N1)流感小鼠模型;分5组,观察各组小鼠死亡率,脾、肺指数及肺指数抑制率。结果:0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY于攻毒前24、6、1小时滴鼻3次显著地预防流感病毒致死率(30.0%),而攻毒后1、6、24小时分别滴鼻3次,此后每天滴鼻1次,持续5天,致死率为20.0%,两组与阳性对照组(致死率90.0%)、非特异性IgY预防和治疗组(致死率80.0%,70.0%)比较差异显著(P<0.01)。0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY预防组和治疗组肺指数显著低于阳性对照组(P<0.05~0.01),其治疗组也低于非特异性IgY预防和治疗组(P<0.05)。结论:抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY感染前后24小时内多次滴鼻能有效地预防和治疗流感病毒感染。     

Recombinant parainfluenza virus 5 (PIV5) expressing the influenza A virus hemagglutinin provides immunity in mice to influenza A virus challenge

Parainfluenza virus type 5 (PIV5), formerly known as simian virus 5 (SV5), is a non-segmented negative strand RNA virus that offers several advantages as a vaccine vector. PIV5 infects many cell types causing little cytopathic effect, it replicates in the cytoplasm of infected cells, and does not have a DNA phase in its life cycle thus avoiding the possibility of introducing foreign genes into the host DNA genome. Importantly, PIV5 can infect humans but it is not associated with any known human illness. PIV5 grows well in tissue culture cells, including Vero cells, which have been approved for vaccine production, and the virus can be obtained easily from the media. To test the feasibility of using PIV5 as a live vaccine vector, the hemagglutinin (HA) gene from influenza A virus strain A/Udorn/72 (H3N2) was inserted into the PIV5 genome as an extra gene between the hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene and the large (L) polymerase gene. Recombinant PIV5 containing the HA gene of Udorn (rPIV5-H3) was recovered and it replicated similarly to wild type PIV5, both in vitro and in vivo. The HA protein expressed by rPIV5-H3-infected cells was incorporated into the virions and addition of the HA gene did not increase virus virulence in mice. The efficacy of rPIV5-H3 as a live vaccine was examined in 6-week-old BALB/c mice. The results show that a single dose inoculation provides broad and considerable immunity against influenza A virus infection.     

东莞市无偿献血者甲型H1N1流感抗体血清学调查

目的 评价无偿献血者接种甲流疫苗的持续免疫效果及未接种甲流疫苗献血者的甲流抗体水平,为防治甲流提供参考依据.方法 应用ELISA法检测2010年1-6月1166例东莞市接种甲流疫苗及1265例未接种甲流疫苗的无偿献血者的甲流抗体.结果 接种甲流疫苗献血者的平均甲流抗体的阳性率及高效价率为78.82％与46.57％,两者在71～90 d达到峰值后维持在较高水平.未接种甲流疫苗献血者的平均甲流抗体阳性率为26.01％;在性别、年龄组别之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 甲流疫苗的持续免疫效果良好,对于甲流的防治有重要作用.未接种甲流疫苗献血者的甲流抗体阳性率低,应加强接种工作.