人端粒酶逆转录酶基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2活性的影响

目的：观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响,探讨hTERT基因与端粒酶的关系及端粒酶活性在肿瘤浸润和转移中的作用。方法：利用重组质粒PCI-Neo-hTERT转染人骨肉瘤细胞系U2OS,选取转染的2个阳性克隆株进行实验,同时以未转染的U2OS细胞为对照。通过RT-PCR和TRAP-ELISA法检测阳性克隆株hTERT基因的转染效果,明胶酶谱法和RT-PCR检测转染hTERT基因对细胞MMP-2的表达和活性的影响。结果：与对照组比较,2个阳性克隆株可见特异性hTERT表达,并表现出明显的端粒酶活性状态（ΔA>0.2　U）。阳性克隆株MMP-2 mRNA的表达无明显改变（P>0.05）,而酶原型MMP-2减少（P<0.01）。结论：hTERT稳定转染克隆U2OS细胞株中异位表达hTERT可以产生端粒酶活性,而且端粒酶活性的出现,可能通过调节MMP的分泌影响细胞外基质成分的降解和构建而对肿瘤的浸润和转移产生一定影响。     

骨肉瘤端粒酶逆转录酶的表达及其临床意义

目的研究骨肉瘤中人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达,为分子免疫学方法治疗骨肉瘤提供基础。方法分别用免疫细胞／组织化学法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞株U2－OS、MG－63、SAOS－2及15例骨肉瘤组织中hTERT表达及端粒酶活性状态。结果HeLa细胞hTERT表达率最高,为95．16％&#177;3．83％;MG-63、SAOS-2、U2-OS细胞系中hTERT阳性率分别为8．75％&#177;1．31％、5．26％&#177;1．22％、2．33％&#177;0．83％;骨肉瘤组织中hTERT表达阳性率26．7％（4／15）。结论hTERT在骨肉瘤的表达率相对较低,仍需用新的研究方法寻找其他分子免疫学治疗骨肉瘤的靶点。     

胡桃楸树皮提取物对SMMC-7721、MCF-7和A549肿瘤细胞的抑制作用及其机制

目的：观察胡桃楸树皮提取物（JMME）对SMMC-7721、MCF-7和A549 3种肿瘤细胞的生长抑制作用,确定其抑瘤的药用价值,通过检测JMME诱导肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性变化阐述其抑瘤机制。方法：分别以25、50、100、200、400和800 mg•L^-1JMME作用于体外培养的SMMC-7721、MCF-7和A549肿瘤细胞72 h,采用MTT法检测生长抑制率;以200 mg•L^-1JMME作用于体外培养的SMMC-7721、MCF-7和A549,于倒置显微镜下观察细胞形态学变化;琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡;PCR-ELISA法检测端粒酶活性。结果：不同浓度JMME（25、50、100、200、400和800 mg•L^-1）对SMMC-7721的细胞生长抑制率(%)分别为13.06、21.77、29.88、41.74、69.82和78.08;对MCF-7的抑制率(%)为24.91、38.63、49.72、61.84、65.69和81.28;对A549的抑制率(%)为12.32、26.21、41.65、55.38、62.87和80.13;与对 照组比较,JMME各浓度作用的3种肿瘤细胞的生长抑制率均升高（P<0.05）,抑制率随JMME对SMMC、MCF-7和A549细胞的浓度的增加而增高（P<0.05）。JMME对SMMC、MCF-7和A549细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为211.21、111.07和176.20 mg•L^-1,对MCF-7的IC₅₀小于其他两种瘤细胞株。经不同浓度JMME作用单位视野内细胞数量明显减少,细胞间隙增大,细胞体积明显缩小,细胞失去原有的形态,胞体皱缩变圆,出现膜发泡现象,对照组无此变化。提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,见DNA Ladder,表明3种肿瘤细胞经不同浓度JMME作用后出现不同程度凋亡。3种肿瘤细胞与阴性对照组比较端粒酶活性升高,而经过JMME作用后端粒酶活性均受到了抑制,抑制率分别为42.86%、73.30%和58.78%。结论：胡桃楸树皮提取物在体外有抗肿瘤活性,其机制可能与其诱导肿瘤细胞凋亡﹑抑制端粒酶活性有关。     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响。方法构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(pshRNA-hTERT)并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点。结果转染乳腺癌细胞后,pshRNA-hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2%;蛋白表达分别下调46.6%,47.8%。端粒酶活性均明显下降。对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加。结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞端粒酶活性及其hTERTmRNA表达的影响

目的探讨甘氨脱氧胆酸钠（glycodeoxycholic acid,GDCA）对肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性以及hTERTmRNA表达影响。方法采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性;应用RT-PCR检测hTERTmRNA的表达。结果GDCA作用肝癌SMMC7721细胞后,端粒酶活性与hTERTmRNA表达均降低,GDCA200、400μmol／L处理组与对照组端粒酶活性（A450nmOD值）分别为（0．140±0．04）、（0．077±0．01）、（0．2484-0．05）,差异有统计学意义（P〈0．05）,抑制率为43．5％和69．0％。hTERTmRNA表达明显降低,相对表达率分别为1．33、0．59、1．89。结论甘氨脱氧胆酸钠抑制肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性,且下调hTERTmRNA的表达。     

高三尖杉酯碱诱导白血病细胞凋亡与人端粒酶逆转录酶及端粒酶的关系

目的 研究高三尖杉酯碱(HHT)诱导白血病细胞调亡与细胞端粒酶和端粒酶逆转录酶(hTERT)水平的关系。方法 在体外，以HL60细胞株细胞为对象，采用半定量RT—PCR法检测hTERT mRNA表达量；采用端粒重复序列扩增法(TRAP)—酶联免疫吸附试验(ELISA)检测端粒酶活性；采用TUNEL法检测凋亡细胞。结果 与空白对照相比，HHT能够下调hTERT mRNA的表达。HHT浓度为0．005—0．030μg／m1时，HL60细胞hTERT mRNA表达无明显变化；当浓度增至0．040—0．050μg／m1，hTERT mRNA表达量下降至检测不出。0．020μg／m1 HHT作用18h后，hTERT mRNA表达呈下降趋势，24h后端粒酶活性明显下降，两者的下降趋势基本相似，但hTERT mRNA表达下降幅度较端粒酶活性下降幅度更大。在HHT作用下，HL60细胞凋亡率增加，而端粒酶活性及hTERT mRNA水平下降，且与HHT浓度或作用时间相关。结论 HHT下调端粒酶活性可能与hTERT mRNA转录水平下降有关。通过下降hTERT mRNA转录和端粒酶活性可能是HHT诱导HL60细胞凋亡的原因之一。     

多西紫杉醇和顺铂联合用药对人乳腺癌MCF-7细胞hTERT及C-myc基因表达的影响

目的研究多西紫杉醇和顺铂联合应用对人乳腺癌MCF-7细胞的作用及其机制。方法MCF-7细胞传代培养后分组加药：第1组加入多西紫杉醇（多西紫杉醇组）；第2组加入顺铂（顺铂组）；第3组加入多西紫杉醇和顺铂（联合用药组）；对照组为未加药的MCF-7细胞。加药24、48、72 h后收集细胞，MTT法检测各组细胞生长抑制率，PCR-ELISA法检测各组细胞端粒酶活性，RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶hTERT mRNA的表达，Western blot技术检测C-myc蛋白的表达。结果联合用药组人乳腺癌MCF-7细胞的生长和增殖受到明显抑制，多西紫杉醇联合顺铂对端粒酶活性、hTERT mRNA及转录调控基因C-myc表达的抑制呈明显的时效和效量相关性。结论多西紫杉醇和顺铂联合应用对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制具有协同加强作用，其机制可能是对MCF-7细胞的端粒酶活性及其端粒酶转录调控基因C-myc有较强的抑制作用。     

体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

目的:筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453端粒逆转录酶(hTERT)基因表达的RNA干扰靶点,为乳腺癌的基因治疗提供依据.方法:构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3),分别转导入乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453.同时以无同源性的siRNA-hTERT4作阴性对照,含GFP基因的载体作阳性对照.应用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化;MTT法检测细胞生长率;流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响.结果:与阴性对照组相比,siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3三个实验组siRNA转染细胞后,hTERT的mRNA表达量下调至21%～40%,蛋白表达下降至50%,而三个实验组间差异无统计学意义(P>0.05).转染48 h后,MCF-7细胞抑制率分别为(57±4.3)%,(61±4.3)%,(65±6.0)%;MDA-MB-453细胞抑制率分别为(45±5.1)%,(45±4.1)%,(50±4.0)%.流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率有所增加,MCF-7细胞为(18.90±0.11)%,(27.30-I-0.18)%,(27.00 4-0.16)%;MDA-MB-453细胞为(12.25 4-0.17)%,(17.80±0.19)%,(20.60 4-0.21)%.结论:经siRNA-hTERTl,siRNA-hTERT2,siRNA-hTERT3处理均可明显抑制MCF-7和MDA.MB-453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达,能够明显促进细胞的凋亡.     

胃癌组织端粒酶活性与催化亚基hTERT表达的关系

研究胃癌、胃黏膜肠化生及正常黏膜组织端粒酶活性与人端粒酶催化亚基(hTERT)表达的相关性及端粒酶激活在胃癌发生中的作用.方法:通过端粒重复序列扩增(TRAP)和逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)方法测定3种胃癌细胞株、26例胃癌、10例胃黏膜肠化生和36例正常胃黏膜组织标本端粒酶活性和hTERT表达.结果:3种胃癌细胞株、24例胃癌组织有端粒酶活性;4例肠化生端粒酶活性较弱;36例正常胃黏膜标本未测到端粒酶活性.hTERT在26例胃癌组织、5例肠化胃黏膜中表达;正常胃黏膜无表达.端粒酶活性、hTERT表达与肿瘤的分期和病理分级无关.结论:hTERT在肿瘤形成的早期阶段表达,端粒酶的激活是胃癌形成的关键步骤.     

反义端粒酶RNA抑制肝癌细胞生长的机制

目的：观察反义端粒酶RNA对SMMC－7721肝癌细胞系的作用,探讨抗端粒端治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法：采用脂质体介导的方式将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTP转入SMMC7721细胞中,经潮霉素筛选,克隆细胞株扩增鉴定后,采用TRAP－PCR－ELISA,FCM及电镜检测反义端粒酶RNA对转染细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响;同时进行裸鼠荷瘤生长实验观察。结果：TRAP－PCR－ELISA法检测细胞端粒酶活性的结果为：实验组吸光度值为0．980,对照组吸光度值为2．861;FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13．8％,对照组未见有凋亡峰形成,电镜观察发现转染细胞表现出典型的凋亡细胞形态。裸鼠移植瘤生长实验发现,转染细胞生长明显受到抑制作用,说明反义端粒酶RNA显抑制SMMC7721细胞的端粒酶活性,并且对其有显的促凋亡作用。结论：反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性,同时显促进癌细胞凋亡。     

Expression of telomerase and its RNA in nasopharyngeal carcinoma

Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ,ａｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｔｈｅｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈ ,ｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃｅｌｌｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ｒｅｃｅｎｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓａｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｉｎｍｏｓｔｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓａｓｗｅｌｌａｓｉｎｉｍｍｏｒｔａｌａｎｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉ…     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

骨肉瘤细胞中端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

目的研究不同骨肉瘤细胞中人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA成分的表达情况。方法用全基因组芯片检测人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOB1．19中hTERTmRNA表达;用逆转录PCR、实时定量PCR法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOBl．19中hTERTmRNA表达。结果全基因组芯片法显示MG-63、SAOS-2、U2-OS、hFOB1．19细胞系中hTERTmRNA表达强度分别为0．9、-0．1、-0．8、11．4,各细胞系均处于相对低表达水平;荧光实时定量PCR法显示MG-63、Hela细胞系中hTERTmRNA相对表达水平分别为1．00±0．08和2．13±0．11,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论hTERTmRNA在骨肉瘤各细胞系中表达率较低,端粒延伸替代机制可能在骨肉瘤端粒维持方面发挥重要作用。     

反义端粒酶RNA与1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖的协同作用

【目的】观察1,25-(OH2)D3对转染反义端粒酶RNA的肝癌细胞增殖的作用。【方法】经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,添加1,25-(OH)2D3分别作用于各实验组细胞后,采用四唑蓝比色实验(MTT)和平板克隆形成实验,检测细胞的存活和生长;TUNEL法检测细胞凋亡。【结果】转染组细胞和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。10 nmol/L浓度的1,25-(OH2)D3对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用;且较之于单独的1,25-(OH2)D3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞增殖的抑制作用,在转染反义端粒酶RNA,降低肝癌细胞端粒酶活性后,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖的作用显著得到增强。各组细胞的凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%。经统计学处理,上述实验结果证实均存在显著的差异(P<0.01)。【结论】在转染反义端粒酶RNA、降低细胞端粒酶活性的基础上,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用进一步得到增强。