SPK/S1P信号途径对人肝癌细胞VEGFmRNA表达的作用

目的探讨鞘氨醇激酶/1 磷酸鞘氨醇信号途径(SPK/S1P)在基因水平对人肝癌细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的调节作用。方法体外培养人肝癌细胞HepG2,利用荧光定量PCR法检测鞘氨醇激酶的特异性抑制剂N,N′ 二甲基鞘氨醇(DMS）作用后肝癌细胞VEGFmRNA的表达。结果不同浓度DMS处理后的HepG2细胞中VEGF基因表达较对照组明显降低,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论DMS可通过阻断SPK/S1P信号途径在基因水平抑制肝癌细胞VEGFmRNA,说明人肝癌细胞VEGFmRNA表达受SPK/S1P信号途径调控。     

SPK/S1P信号途径对人肝癌细胞增殖、凋亡的作用

目的探讨鞘氨醇激酶/1 磷酸鞘氨醇信号途径（SPK/S1P）对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2,观察5～20?μmoL/L浓度范围鞘氨醇激酶的特异性抑制剂N,N′ 二甲基鞘氨鞍醇（DMS）对HepG2细胞增殖、凋亡的影响。结果MTT实验结果显示,5～20?μmoL/L浓度范围的DMS对细胞增殖均有抑制作用,透射电镜观察对照组细胞可见细胞凋亡的变化,TUNEL标记法检测处理组阳性细胞表达百分数较对照组明显增多（P＜0.01）。结论DMS对HepG2细胞的生长增殖具有抑制作用,并促其发生凋亡。     

SPK1/S1P信号途径对人肝癌耐药细胞株BEL-FU凋亡、侵袭力及耐药特性的影响

目的 研究利用N,N,-二甲基鞘氨醇（dimethyl sphingosine,DMS）干涉鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇（SPK1/S1P）信号后对人肝癌耐药细胞株BEL-FU的凋亡、侵袭能力及耐药特性的影响。方法  利用不同浓度的DMS处理人肝癌耐药细胞株BEL-FU,观看凋亡形态变化,检测凋亡发生;并用transwell小室模型测定侵袭力;Western blot杂交检测多药耐药相关蛋白1（MRP1）表达的变化。结果  随着DMS浓度的升高,细胞凋亡率增加,浓度组与对照组及各浓度组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）,且呈剂量依赖效应;同时可观察到侵袭力减弱,各浓度组穿膜细胞数、抑制率与对照组比较及组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）,且呈剂量依赖效应;MRP1蛋白表达量明显减少,浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论  SPK1/S1P信号和肝癌细胞的侵袭和耐药密切相关,利用DMS干涉SPK1/S1P信号能引起人肝癌耐药细胞株BEL-FU的凋亡、降低其侵袭力并且克服其耐药。     

BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的 研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响.方法 使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞.利用RT-PCR鉴定病毒转染.Western Blot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量.应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响.结果 RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功. 高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高.随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少.结论 BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌.     

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响.方法 培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次.DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达.结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡.     

外源性1-磷酸神经鞘氨醇(S1P)对大鼠骨骼肌成肌细胞DNA合成的影响

 目的  观察外源性1-磷酸神经鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)对大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的影响。方法  分离和培养大鼠骨骼肌成肌细胞,通过制备S1P脂质体使S1P转运到骨骼肌成肌细胞内或直接加入外源性S1P,采用3H-TdR渗入法检测S1P进入细胞内和在细胞外对骨骼肌成肌细胞DNA的合成;进一步使用磷酸神经鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)活性抑制剂N,N 二甲基鞘氨醇(N,N dimethyl sphingosine,DMS)和HACPT ［2-(p-hydroxyanilino)-4-(p-chlorophenyl) thiazole］,观察其对S1P促进DNA合成作用的影响。结果  S1P脂质体转入可明显促进骨骼肌成肌细胞DNA合成。100~1 000 nmol/L剂量范围内S1P脂质体使细胞胸腺嘧啶核苷(3H TdR)的摄入量较对照组增加 12.3%~50.7% (P<0.01),并与剂量呈正相关。该促进作用不会被SphK活性抑制剂DMS和HACPT所阻断。S1P直接加入培养液同样能促进细胞DNA合成(P<0.01),500和 1 000 nmol/L剂量组3H-TdR的摄入量较对照组分别增加18.8% (P<0.05)和26.5% (P<0.05),增幅低于同剂量的S1P脂质体。该促进作用可被DMS和HACPT所阻断。结论  外源性S1P可促进体外培养的大鼠骨骼肌成肌细胞增殖,其作用可能与细胞内SphK活性增加引起细胞内S1P生成增多。     

SPK、S1P蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的：探讨鞘氨醇激酶1(SPK1)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法：选择行手术治疗的73例骨肉瘤病人作为观察对象,选择同期骨软骨瘤手术切除标本31例作为对照,免疫组织化学法检测骨肉瘤组织与软骨瘤组织中SPK1、S1P蛋白表达水平,分析SPK1、S1P表达水平与骨肉瘤临床病理特征的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析SPK1、S1P表达与骨肉瘤病人生存率的关系。结果：骨肉瘤组织SPK1阳性表达率为68.49%,高于软骨瘤组织中阳性表达率16.13%(P<0.01);骨肉瘤组织S1P阳性表达率为58.90%,高于软骨瘤组织中阳性表达率22.58%(P<0.01);SPK1、S1P在Eneeking分期为Ⅱ～Ⅲ期和肺转移的病人中阳性表达率较高(P<0.05～P<0.01);SPK1、S1P在病人的不同性别、年龄、肿瘤直径、发病部位、病理类型的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05);SPK1阳性表达组3年生存率低于SPK1阴性表达组(P<0.05);S1P阳性表达组3年生存率低于S1P阴性表达组(P<0.05)。结...     

1-磷酸鞘氨醇在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用及其机制探讨

目的探讨1-磷酸鞘氨醇(S1P)在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用及其机制。方法取人脐带静脉内皮细胞培养,取5代以内对数生长周期的细胞进行实验,检测各组24 h细胞活力水平、细胞凋亡水平,PLC(磷脂酶C)、Src激酶拮抗剂与S1P混合作用凋亡水平、Akt激活情况。结果正常对照组、甘露醇高渗对照组的细胞活力以及细胞凋亡差异无统计学意义(P0.05)。在高糖处理下,细胞活力显著下降,细胞凋亡水平显著上升。模型组1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L剂量条件下细胞活力高于高糖处理组、细胞凋亡率低于高糖处理组,呈剂量依赖,差异具有统计学意义(P0.05)。在含有10μmol/L浓度S1P的培养液中分别加入PLC抑制剂U63122、Src激酶抑制剂PP2,则凋亡率逐渐上升,差异有统计学意义(P0.05)。应用U73122阻断PLC后,Akt磷酸化无显著的变化,PTX、S1P、U73122(P0.05),添加Src激酶抑制剂PP2后,Akt的磷酸化水平显著下降(P0.05)。结论1-磷酸鞘氨醇在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中起到抗凋亡作用,可能与其调节Src/Akt通路功能有关。     

鞘氨醇激酶在恶性肿瘤中的研究进展

在许多肿瘤的发生发展过程中,鞘磷脂的代谢产物神经酰胺（ceramide,Cer）、神经鞘氨醇（sphingosine,Sph）和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）发挥着极为重要的作用,它们调节着细胞的增殖、存活和凋亡。在细胞内,这些代谢产物可以相互转化,鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,SphK）则是维系Cer、Sph和S1P三者间代谢平衡的关键酶,具有调节Cer和S1P的双重功能。SphK在多种实体肿瘤中均有表达,其基因具有癌基因的特征,并且通过Sphk/S1P信号途径对肿瘤发挥着促进细胞生长,保护其免受凋亡,使肿瘤细胞产生放化疗耐受的作用。而Sphk抑制剂的应用实现了其活性的下调,阻滞了其在恶性肿瘤中的作用。因此,Sphk的靶向肿瘤治疗有可能实现对肿瘤更为有效的控制,具有良好的应用前景。     

鞘氨醇激酶在恶性肿瘤中的研究进展

在许多肿瘤的发生发展过程中,鞘磷脂的代谢产物神经酰胺（ceramide,Cer）、神经鞘氨醇（sphingosine,Sph）和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）发挥着极为重要的作用,它们调节着细胞的增殖、存活和凋亡。在细胞内,这些代谢产物可以相互转化,鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,SphK）则是维系Cer、Sph和S1P三者间代谢平衡的关键酶,具有调节Cer和S1P的双重功能。SphK在多种实体肿瘤中均有表达,其基因具有癌基因的特征,并且通过Sphk/S1P信号途径对肿瘤发挥着促进细胞生长,保护其免受凋亡,使肿瘤细胞产生放化疗耐受的作用。而Sphk抑制剂的应用实现了其活性的下调,阻滞了其在恶性肿瘤中的作用。因此,Sphk的靶向肿瘤治疗有可能实现对肿瘤更为有效的控制,具有良好的应用前景。     

人肝癌细胞株VEGF/VEGFR的检测及意义探讨

目的：筛选血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达肝癌细胞株，为进一步研究VEGF在肝癌治疗中的作用提供理论依据。并探讨VEGF受体在肝癌细胞株的表达及意义。方法：ELISA法及Western blot法分别检测人肝癌细胞株培养上清及细胞内VEGF蛋白的表达。免疫细胞化学方法检测VEGFR在人肝癌细胞中的表达。结果：5株肝癌细胞株均见VEGF蛋白表达，其中SMMC-7721的VEGF表达量最高，VEGF特异性受体Fit-1在HepG2、HHCC、SMMC-7721、Bcl-7402见阳性表达，KDR在HepG2、HHCC、Bel-7402、QGY-7701见阳性表达。结论：肝癌细胞株中VEGF表达量不尽一致，VEGF在肝癌发生发展中可能存在自分泌作用方式。     

鞘氨醇激酶对胃癌细胞凋亡作用的初步研究

目的:研究鞘氨醇激酶(SPK)对胃癌细胞凋亡的作用。方法:氯化铯密度梯度离心法纯化携带人野生型(rAd-SPKWT)及突变体(rAd-SPKDN)SPK的腺病毒,用噬斑分析和快速CPE法测定病毒感染滴度。以腺病毒为载体将SPK基因导入胃癌细胞BGC-823。分别以Westernblot、酶活性法检测外源基因表达和SPK酶活性。结果:获得了高滴度的rAd-SPKWT、rAd-SPKDN腺病毒;腺病毒能高效感染胃癌细胞BGC-823;外源SPK在胃癌细胞能有效表达,rAd-SPKWT增强SPK活性,rAd-SPKDN抑制SPK活性;高表达SPK可以抑制胃癌细胞对5-FU的敏感性,阻断SPK可以增强其对5-FU的敏感性。结论:SPK可以抑制胃癌细胞凋亡,SPK有可能成为胃癌新的治疗靶点。     

alphastatin抑制体外内皮细胞血管生成及其作用机制的实验研究

目的探讨人纤维蛋白原α链末端的24个氨基酸片断alphastatin对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成抑制作用及机理。方法体外培养ECV304细胞,分别测定alphastatin对其迁移、增殖和体外管状结构形成的作用。用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定性检测ECV304细胞中鞘氨醇激酶(SPK)mRNA的表达。分别以10、100、1000nmol/Lalphastatin处理ECV304细胞,提取细胞蛋白质,通过三磷酸腺苷(ATP)检测细胞SPK酶活性。结果不同浓度alphastatin处理组中ECV304细胞迁移的数目,分别为(103±4)个、(75±3)个、(13±1)个,低于对照组的(131±4)个,均P<0·05。alphastatin浓度为100nmol/L、1000nmol/L时,形成管状结构的面积分别为(1509±30)μm2/视野和(1301±20)μm2/视野,也明显低于对照组的(2996±31)μm2/视野,均P<0·05。alphastatin对ECV304细胞增殖的影响差异无统计学意义。RT-PCR证实ECV304细胞SPKmRNA的表达。与对照组比较,alphastatin降低ECV304细胞内1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成量,当其浓度为100nmol/L,作用时间为12h时,效应最明显。结论体外实验证实alphastatin具有明显抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与降低细胞SPK活性、减少S1P的生成有密切关系。     

携带SPK1基因的质粒预防术后肠粘连的实验研究

目的观察质粒pcDNA3-SPK1在大鼠术后肠粘连模型中的表达效率及鞘氨醇激酶（SPK1）基因转移对术后肠粘连的预防作用。方法大鼠腹膜间皮细胞分离培养,pcDNA3-SPK1质粒转染大鼠腹膜间皮细胞,Westrn bolt检测SPK1蛋白的表达和γ-P32掺入法检测SPK酶活性;利用绿色荧光蛋白（GFP）为标志基因,评价质粒载体在手术损伤腹膜中的基因转移效率;利用无菌干纱布擦伤盲肠,建立大鼠术后肠粘连模型,评价SPK1基因转移对术后肠粘连的预防作用。结果 pcDNA3-SPK1质粒能有效转染损伤腹膜并介导SPK1基因表达;在大鼠术后肠粘连模型中,pcDNA3-SPK1基因转移能使术后重度肠粘连（3-4°）的发生率从80%降至30%。结论质粒pcDNA3-SPK1可有效预防术后肠粘连的发生。     

三氧化二砷影响肝癌细胞血管内皮生长因子表达信号转导机制的初步探讨

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）影响人肝癌细胞株HepG2表达血管内皮生长因子（VEGF）的信号转导机制。方法：体外培养肝癌细胞系HepG2,实验分为：①空白组、②对照（As2O3）组、③As2O3＋PKC阻断剂（H7）组、④As2O3＋P38阻断剂（SB203580）组、⑤As2O3＋H7＋SB203580组;半定量RT—PCR技术检测HepG2细胞VEG-FmRNA相对表达量。结果：②、③、④、⑤纽均有VEGF的表达,与①组相比差异有统计学意义（P〈0．01）,③、④组与②组相比无差异;⑤组与②组相比VEGF的表达明显降低,P〈0．05;结论：三氧化二砷可诱导HepG2细胞表达VEGFmRNA,并可能通过PKC和／或P38信号通路影响VEGFmRNA的表达。