长波紫外线对无血清培养人角质形成细胞增殖的影响

目的建立人角质形成细胞无血清培养方法;观察长波紫外线对无血清培养的人角质形成细胞增殖活性的影响．方法采用两步消化法分离角质形成细胞,并用K-SFM无血清培养液培养,观察细胞形态并行角蛋白K19免疫组织化学染色鉴定;采用0、3．07、6．14、12．29、24．58J／cm2剂量的长波紫外线（UVA）照射细胞,以改良四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性．结果免疫组织化学鉴定结果示,细胞阳性率接近100％;随UVA剂量的增加,其损伤率分别为0％、7．27％、32．73％、72．73％及95．45％,引起半数细胞损伤的UVA剂量为8．09J／cm2．结论体外无血清培养可获取较多高纯度的角质形成细胞,是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法;在此体系中,UVA对角质形成细胞的损伤作用与剂量相关．     

人表皮角质形成细胞的体外改良培养

目的:探讨人表皮角质形成细胞的体外改良培养方法。方法:取皮肤标本,先用 2. 5g/L胰蛋白酶 4℃浸泡 22h(冷消化法),以便于表皮真皮分离;分离后刮除真皮面 (真皮刮除法 )以获取基底细胞;收集表皮及基底细胞并混合,制成细胞悬液进行培养。培养至第 5d,采用人工纯化法去除成纤维细胞。其他操作同人表皮细胞常规培养法。培养结束后,以台盼蓝染色法检测细胞存活率,观察细胞生长状态,并与传统培养方法相比较。实验重复 3次。结果:改良组 3次培养细胞存活率分别为 87%, 91%和 95%,均高于对照组 ( 82%, 82%和 85% ) (P<0. 05)。改良组生长速度亦较快。结论:采用人工纯化法、冷消化法和真皮刮除法等改良方法可提高体外培养的人表皮角质细胞存活率及生长速度。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的：建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法：采用两步消化法对皮肤进行消化，获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养，进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果：该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞，且在体外可快速稳定增殖。结论：两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养

目的 探索用DMEM—SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件。方法 取临床整形外科手术后剩余皮肤，用0．25％的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后，用DMEM—SF、完全培养基于5％CO2、37℃培养，绘制生长曲线，并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠—IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定。结果 用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在：DMEM—SF、培养基中可正常生长2周以上，生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期，第10天进入停滞期。鉴定显示角质形成细胞占95％以上。来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比，细胞生长无统计学差异。结论 用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞，在DMEM—SF完全培养基中生长状况良好，其他细胞污染少，实验成本低廉，操作简单。     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

人皮肤角质形成细胞无血清原代培养方法的建立

目的 建立人皮肤角质形成细胞体外无血清、无牛垂体提取物及无饲养细胞的原代培养方法.方法 应用胰蛋白酶.EDTA冷温两步消化法消化健康青年包皮皮肤,获取角质形成细胞并置于无血清、无牛垂体提取物、成分确定的角质形成细胞培养基中进行原代培养并传代.通过观察细胞形态和采用免疫组织化学方法鉴定及绘制生长曲线,分析、评价细胞质量.结果 该方法可稳定获得高纯度、活性好的角质形成细胞.原代角质形成细胞可稳定增殖2周左右,至少可稳定传代增殖5代.经免疫组织化学方法鉴定,99%以上为角质形成细胞.结论 冷温两步消化法及体外无血清原代培养技术可为科研工作提供足量高质量的角质形成细胞,是高效经济的获得人角质形成细胞的方法.     

小鼠角质形成细胞培养研究进展

角质形成细胞（keratinocyte）是构成表皮的主要细胞类型,位于皮肤的最外层,在构成人体抵御外界伤害的第一道防线中起着至关重要的作用。小鼠角质形成细胞的体外培养对于表皮屏障、瘢痕形成、银屑病等生理病理机制以及关键分子的调控等功能研究和人工皮肤等临床应用具有重要价值。角质细胞的培养历史可以追溯到20世纪70年代,半个世纪以来,小鼠角质细胞的培养经历了从复杂到简单的过程,但是目前仍有一些诸如细胞易分化、衰老,传代困难等问题。本文就近年来国内外有关小鼠角质细胞分离培养的文献进行综述,总结影响角质细胞体外增殖、分化的各个因素,以期建立更加优化的培养体系,进而服务于各类基础和临床研究。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

表皮细胞培养与移植研究Ⅰ、人角化细胞在三种培养法中生长的观察

应用三种培养方法观察人角化细胞生长、增殖与形成膜片的过程,共111次。人表皮细胞单层细胞生长率3T3饲养层培养法最高达80.0％;皮块培养法为52.5％;细胞悬液培养法仅为11.8％。3T3饲养层培养法效果最佳,优点较多,值得选用。皮块培养法简便易行,效果也可,如能设法排除成纤维细胞混合生长,仍为可选用的培养方法。     

用建立的BA-ELISA检测尿毒症患者血清转铁蛋白的含量

过去检测人血清转铁蛋白(Transferrin,Tf)水平,常用总铁结合力(TIBC法)或环状单向免疫扩散法(SRID)进行。不仅用血量大,且方法繁琐,灵敏度差。为此,我们制备提纯了人血清Tf及兔抗人Tf抗体,建立了生物素-抗生物素蛋白-酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)检测Tf含量的方法,检测限量为0.8ng/ml,检测范围在1～120ng/ml。用于检测的血清样本以1:40000稀释,测得健康人(正常组n=40)血清Tf均值为3.02±0.32mg/ml,尿毒症患者(n=19)血清Tf均值为1.73±0.60mg/ml,明显低于正常组(P<0.001)。本法操作简便,灵敏度高,特异性强,血清量仅需10μl,适用于临床普查及对肾病患者的血清Tf含量的检测。     

2型糖尿病患者血清微量元素研究

目的 :研究微量元素与 2型糖尿病的关系。方法 :对 40例 2型糖尿病患者血清锌、铜、铬、硒、铁、钙、镁 7种元素加以测定 ,并与正常健康对照组 30例相比较。全部数据均采用 Spss7.5统计分析软件处理。结果 :2型糖尿病患者血清锌、铬、硒明显低于对照组 ,( P分别 <0 .0 5,<0 .0 1 ) ;血清铜、铜 /锌比值显著高于对照组 ( P<0 .0 1 ) ;血清铁、钙、镁两组无差异。单因素相关分析显示 :2型糖尿病患者血清锌、硒、铬元素含量与血糖呈负相关 ,血清铜、铜 /锌比值与血糖呈正相关 ,各微量元素含量与糖化血红蛋白 Hb A1c均无显著相关关系。多元回归分析 ,与血糖关系最密切的微量元素依次为血清硒、铬和铜 /锌比值。结论 :血清微量元素确实与糖尿病有密切的关系 ,当中尤以低血硒、低血铬、高铜 /锌比值是影响糖尿病病情及其并发症的重要因素。提示在糖尿病病人中应注意微量元素的补充 ,这对防治糖尿病及其并发症均有积极意义     

乙型肝炎病毒细胞培养模型中人白蛋白的研究

本文建立了用ＥＬＩＳＡ法测定ＨｅｐＧ２ ２２１５细胞培养液中人白蛋白的方法，其线性测定为０．１６～４０ｎｇ／ｍｌ，各种阴性对照Ｐ／Ｎ值均小于２．１。批内变异系数为３．４％，批间变系数为８．５％。本实验结果说明，在利用Ｈｅｐｇ２ ２２１５细胞系研究抗乙肝病毒药物和免疫因子的作用时，应注意这些药物或因对细胞代谢有无毒性作用，细胞培养液中人白蛋白的测定可作为检测细胞毒性的一项指标。     

UVA对人角质形成细胞的氧化损伤作用

①目的　探讨紫外线A(UVA)对人角质形成细胞氧化损伤的机制。②方法　用 5J/cm2 UVA照射角质形成细胞 ,酶生化法检测活性氧 (ROS)的含量及超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)活性的变化 ,流式细胞仪测定紫外线对角质形成细胞凋亡的影响 ,原位杂交技术观察 p2 1mRNA的变化 ,并与非照射组比较。③结果　与对照组比较 ,UVA照射组ROS含量升高 (t =113.6 8,P <0 .0 0 1) ,SOD、GSH PX活性下降 (t =5 7.2 3、19.0 4 ,P <0 .0 0 1) ,细胞凋亡率升高 (t=5 3.2 8,P <0 .0 0 1) ,p2 1mRNA表达增强。④结论　UVA对人角质形成细胞的损伤与氧自由基生成增多及细胞抗氧化能力抑制有关     

消化系统癌肿病人血清T_3、T_4变化及其临床意义

测定76例消化系统癌肿病人的血清T_3、T_4浓度.与正常对照组和良性疾病组比较,发现T_3明显降低,T_4无显著性变化.不同种类消化系统癌肿(胃癌、大肠癌、原发性肝癌、胰腺癌)病人之间血清T_3、T_4从浓度元显著性差异.将病人依据手术和病理结果分为轻、中、重三组比较,发现病变程度与血清T_3水平有关,病变越严重,T_3浓度越低.结果表明,消化系统癌肿病人可出现低T_3综合征,T_3可作为估计病变程度和能否根治性切除的指标.     

体外培养人胚胎肝上皮细胞方法探讨

采用组织块培养法培养的人胚胎肝上皮细胞于培养后第３－９天即在贴壁组织块周围长出，并可在体外较长期进行培养；传至第８代时仍能分泌甲胎蛋白（ＡＦＰ），含量为１５－４０μｇ／Ｌ。组织块培养法不失为一种较为简单、实用、经济和有效的方法，为探索人胚细胞体外培养方法提供了参考、借鉴的途径。实验还发现人胚胎肝新生细胞长出与组织块贴壁率密切相关。     

人胚气管器官培养及其在建立肺癌离体器官模型的应用

本实验在国内首次进行人胚气管器官培养,在此基础上以3、4苯胼芘作用,第一周时气管上皮细胞发生扁平鳞状化生,第二周出现上皮细胞复层增生和不典型增生等癌前病变。与利用鼠类气管培养进行致癌试验相比,人胚气管器官培养形成病变早而明显。人胚气管材料更适于建立实验性肺癌器官模型。     

人表皮细胞的体外培养

目的：对表皮细胞在不同的培养方法、不同的培养液及不同底物中的生长情况进行３方面的探讨，以便选出较好的一种组合进行表皮细胞培养，为改善烧伤皮源不足的问题打下基础。方法：①采用人包皮或体皮制成皮块、皮粒、表皮细胞悬液进行液体培养，比较３种方法中表皮细胞生长情况；②应用纯表皮细胞悬液进行空气液体界面培养，平铺平皿培养及培养瓶液体培养，比较表皮细胞贴壁、生长情况；③另将表皮细胞悬液接种于３种不同的培养液，即ＲＰＭＩ１６４０，ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ及ＭＥＭ比较细胞生长差异。结果：①在适当的条件下，离体的皮肤皮块、皮粒及表皮细胞悬液经培养皆能生长和分化，而表皮细胞悬液生长速度较快，纤维母细胞污染机会最少；②以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面法，细胞生长速度最快，培养出的单层表皮细胞膜片易取出，不收缩；③表皮细胞在ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０及ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ３种培养基中的生长情况基本一致。结论：以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面培养法应得到推广应用，它不仅加快了表皮细胞的生长速度，减少了纤维母细胞的污染，易于移植，同时解决了以往各种人工敷料仅针对Ⅱ度烧伤创面的治疗及暂时覆盖Ⅲ度创面的局限