转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗多巴胺毒性作用的研究

目的：探讨囊泡单胺转运体（vesicular monamine transporter-2,VMAT2）对多巴胺（dopamine,DA）毒性的抵抗作用。方法：采用细胞免疫荧光染色法测定VMAT2基因在转染的CHO细胞（VMAT2-CHO）中的表达;MTT比色法检测不同浓度DA作用下的野生型CHO（WT－CHO）和VMAT2-CHO细胞存活率;应用ELISA法DA检测试剂盒测定细胞内DA的水平;采用活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧的水平。结果：VMAT2-CHO细胞内有较强的特异性荧光表达,主要定位在核周区域,胞浆中也有散在的荧光; 0.25～0.4mmol/L DA作用72h, VMAT2-CHO细胞存活率显著高于WT-CHO细胞（P<0.05）;0.4mmol/L DA作用于WT-CHO和VMAT2-CHO细胞24?h,VMAT2-CHO细胞内DA为（199.33±15.155）ng/ml,显著高于WT-CHO细胞（141.4±8.784）ng/ml（P<0.01）;而细胞内活性氧（ROS）水平则由（144.490±5.295 ）U/106cells增加至WT CHO细胞的（217.895±15.885）U/106cells（P<0.01）。结论：转染VMAT2的CHO细胞对DA引起的毒性有显著的抵抗作用。     

β-synuclein 对Ⅱ型囊泡单胺转移体表达的促进作用

目的探讨β-突触核蛋白(β-synuclein)对Ⅱ型囊泡单胺转移体(VMAT2)表达的影响。方法通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测β-synuclein稳定表达对细胞内ROS水平的影响;采用免疫荧光双标法、免疫组织化学法及Western blotting检测VMAT2在稳定转染β-synuclein的SH-SY5Y细胞及正常SH-SY5Y细胞中的表达情况。结果 DCFH-DA荧光染色显示,稳定表达β-synuclein的细胞的荧光强度较正常SH-SY5Y细胞明显减弱。VMAT2在稳定转染β-synuclein的SH-SY5Y细胞中的表达水平较正常SH-SY5Y细胞明显升高。结论β-synuclein能够促进VMAT2的表达,减少胞浆内DA含量,抑制ROS产生,在帕金森病多巴胺神经元变性过程中对其起到保护作用。     

mTLR2基因在CHO细胞中的表达

目的在CHO细胞中表达小鼠TLR2(mTLR2)。方法将目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,并将其转染到CHO细胞,用G418筛选阳性克隆。采用PCR方法,检测外源基因的整合。采用Westernblot、免疫组织化学对转染细胞的mTLR2表达进行鉴定。结果成功构建了pcDNA-mTLR2重组质粒。将其转染到CHO细胞,经G418筛选获得阳性细胞克隆。阳性细胞克隆经PCR检测表明TLR2基因得到稳定整合。Westernblot分析显示在分子量约95000处可见清晰的阳性反应条带。免疫组织化学检测显示转染细胞表达mTLR2。结论获得了表达mTLR2的细胞株,为进一步进行相关研究奠定了基础。     

人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立

目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.     

利血平对转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗鱼藤酮及多巴胺毒性作用的研究

目的研究单胺囊泡转运蛋白 2（VMAT2）抑制剂利血平（RE）作用于转染VMAT2基因的中国仓鼠卵巢细胞（VMAT2 CHO）时,VMAT2 CHO对鱼藤酮（Rotenone）、多巴胺（DA）的毒性抵抗作用。方法采用MTT比色法检测RE与不同浓度Rotenone及DA共同作用下的VMAT2 CHO细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果Rotenone对VMAT2 CHO细胞有毒性作用,随浓度增大,细胞存活率下降;Rotenone和DA对细胞有协同毒性作用。随DA浓度增大,VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加;VMAT2抑制剂利血平增加DA的毒性,使同样浓度的DA诱发VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加,存活率下降。结论RE使VMAT2功能抑制时DA在胞浆内聚集,触发DA内源性毒性,通过氧化应激系统而发挥毒性作用。DA内源性毒性可协同环境毒物Rotenone增加对细胞的毒性作用。     

Delta4的功能性研究及与其他Notch配体的比较

目的：探讨Delta4基因在Notch传导机制中的作用。方法：构建pTracer．CMV．Delta4．FLAG载体，瞬时转染COS7细胞、稳定转染CHO细胞，筛选高表达Delta4的稳定CHO细胞系。用Luciferase分析，观察并比较Delta4对Notch1—CHO及Notch2-CHO两个宿主细胞的信号功能活性，与Deha1、Jagged1及Jagged2比较，从而对此基因定性并获知其信号功能活性水平。结果：Western—blot证实pTracer．CMV．Delta4．FLAG可瞬时转染COS7细胞及稳定转染CHO细胞，并根据Delta4蛋白表达条带的强弱筛选高表达Delta4-CHO细胞系。Delta4对Notch1及Notch2均具有信号功能活性，且对后者的活性功能水平大于前者。对Notch1，Delta4的功能活性略低于Jagged2，但高于Deha1及Jagged1；对Notch2，Delta4的功能活性低于Delta1、Jagged1及Jagged2，但亦具有较强的活性水平。结论：建立的Delta4-CHO细胞系功能稳定，Delta4为Notch1及Notch2的配体，且对Notch2的活性水平高于Notch1。     

抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶（AT）基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制。方法构建AT野生型和突变体表达质粒（ATwt、ATT98I、ATA404T）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR（RT—PCR）检测转染细胞ATmRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径。结果ATT98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,ATA404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解。RT—PCR显示,与野生型ATmRNA相比,突变体ATmRNA不降低。脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解。蛋白降解抑制实验显示,突变体ATT98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解。转染细胞荧光染色显示,转染ATT98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染ATA404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集。结论分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制。     

不同核心启动子对中国仓鼠卵巢细胞重组蛋白表达的影响

目的 探讨不同核心启动子对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组蛋白表达的影响.方法 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,分别构建以巨细胞病毒(CMV)启动子、Natural CMV启动子、超级核心启动子(SCP)2和SCP3驱动的表达载体并转染CHO细胞,根据转染表达载体的不同将细胞分为对照组、Natural C...     

巨细胞病毒和猴空泡病毒40启动子在中国仓鼠卵巢细胞中驱动基因表达效率比较

目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将表达载体质粒分别转染CHO-K1细胞,倒置荧光显微镜观察转染后CHO-K1细胞中EGFP的表达情况;流式细胞术检测EGFP的荧光强度,以比较2种启动子驱动外源基因表达的效率。结果 2种启动子均能够驱动EGFP在CHO-K1细胞中表达。转染质粒pWTY-02的CHOK1细胞的平均荧光强度明显高于转染质粒pWTY-03的CHO-K1细胞(P<0.05)。结论 CMV启动子在CHO-K1细胞中驱动EGFP的表达效率较高,为后续CHO表达系统中提高外源基因表达效率启动子的选择提供了依据。     

应用绿色荧光研究人抑瘤素基因在CHO细胞中的表达

目的：建立一种简易、快速检测细胞内外源性基因稳定表达的方法。方法：以携带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1为骨架，将完整的 hOSM基因ORF克隆到pEGFP-N1上游的多克隆位点，构建表达载体pOSM-EGFP-N1，脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），G418筛选，挑选阳性克隆。荧光显微镜、流式细胞术分析转染了pOSM-EGFP-N1质粒的CHO细胞纯度。RT-PCR的方法分析OSM基因水平表达。结果：成功建立稳定表达OSM的CHO细胞株（CHO-OSM-EGFP），纯度达到99.76%，且OSM基因在CHO-OSM-EGFP细胞中稳定表达。结论：构建了携带绿色荧光、表达OSM的pOSM-EGFP-N1质粒转染的CHO细胞，只通过荧光显微镜观察和FCM检测细胞绿色荧光，即可明确OSM转染成功。为表达外源性基因阳性细胞的筛选提供了简易的方法。     

转基因中国仓鼠卵细胞中单胺囊泡转运体抗毒性作用的研究

目的:研究转基因中国仓鼠卵(CHO)细胞中单胺囊泡转运体(VMAT_2)的抗毒性作用。方法:利用转PC12细胞基因到CHO细胞中形成的转基因CHO细胞(cDNA-CHO),采用MTT比色法检测1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)对CHO细胞野生株(wtCHO)和cDNA-CHO细胞的毒性作用,并观察利血平——VMAT_2的特异性阻滞剂对MPP~+毒性作用的影响。结果:在MPP~+ 0.5mmol/L以上浓度cDNA-CHO细胞对MPP~+敏感性比wtCHO低得多;cDNA-CHO和wtCHO对鱼藤酮(rotenon)的敏感性无显著差异;加入利血平后,上述保护作用消失,cD-NA-CHO对MPP~+敏感性与wtCHO细胞无差异,而单独予以wtCHO细胞利血平则不能改变它对低浓度MPP~+的敏感性。结论:此保护机制是由转基因细胞中VMAT_2引起的,VMAT_2在转基因的非神经细胞系(CHO细胞系)中也能将MPP~+转运至囊泡内,从而保护细胞,同时也提示PC12细胞内具有抗毒性作用的成分。     

人胰岛淀粉样多肽沉淀细胞模型的体外构建

目的构建人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)基因真核表达载体,并在无内源性IAPP表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株上进行体外表达实验,建立可产生hIAPP沉淀的细胞模型。方法应用RT-PCR技术扩增得到hIAPP cDNA,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-IAPP;随后用lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以Thiaflavin S染色的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果构建的pcDNA 3.1-hIAPP真核表达体系成功转染体外培养的CHO细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,转染后培养48 h内的CHO细胞用Thioflavin S染色,与阴性对照相比较,证实有hIAPP的表达而导致细胞内淀粉样沉积发生。结论构建了hIAPP真核表达质粒,并成功在体外表达,从而建立了可产生IAPP淀粉样沉淀的体外哺乳动物细胞模型,为进一步研究胰岛淀粉样沉积的发病机制提供了良好的平台。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在 C H O 细胞中的表达

目的： 克隆造血干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ）并在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达。方法： 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从ｐ Ｒ Ｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ（含 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ）中钓取 Ｓ Ｃ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 膜外段活性区,克隆入真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,转染入 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞;用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。结果：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞可表达 Ｓ Ｃ Ｆｍ Ｒ Ｎ Ａ,其细胞培养上清可协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ刺激骨髓细胞形成集落数比 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 单独作用高 ２ 倍,转染外源基因对细胞周期没有明显影响。结论：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达,转染细胞上清协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 刺激骨髓细胞集落的形成,而本身对集落的形成没有影响。     

Ⅱ型单胺囊泡转移体在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的构建稳定表达Ⅱ型单胺囊泡转移体（VMAT2）的SH-SY5Y细胞系。方法构建VMAT2真核表达载体，利用脂质体转染神经母细胞瘤SH-SY5Y，选择筛选后挑取单克隆扩大培养，通过Western-blot及免疫荧光的方法鉴定蛋白质在细胞中的表达，并通过免疫双荧光技术对VMAT2在细胞系中的分布进行定位。结果Western-blot及免疫荧光结果显示该蛋白在挑选的细胞系中有高效表达。免疫双荧光结果显示表达的蛋白定位在大密度核心囊泡（LDCV）。结论该细胞系的成功构建为研究VMAT2在帕金森氏病（PD）发病机制中的作用奠定良好的基础。     

稳定表达犬转铁蛋白受体CHO细胞系的建立和鉴定

目的 构建犬转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,建立稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。方法 从犬腺细胞系（WRD）提取总RNA,逆转录合成 cDNA,采用PCR方法扩增TfR 基因,将其克隆至真核表达载体pCDNA3,酶切和测序鉴定;利用脂质体法转染CHO细胞,通过RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR的表达。结果 构建的pCDNA3-TfR 重组质粒经过酶切和测序鉴定,TfR 基因序列成功插入到pCDNA3载体,且无突变。转染CHO细胞后,RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR表达阳性,成功建立了稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。HTH]结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3-TfR ,并获得了稳定表达TfR的CHO-TfR 细胞系。