不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因克隆和序列分析

目的　获取淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因。　方法　通过正、反向抑制性差减杂交获取对溴氰菊酯抗药性和敏感性淡色库蚊的差异表达基因 ,并以基因芯片和逆 Northern对所获基因进行杂交鉴定。　结果　正、反向抑制性差减杂交各获得 5 2 3和 2 86个克隆 ,经芯片鉴定后在抗性品系高表达的基因分别有15 5个 (2～ 3倍 )和 42个 (3倍以上 ) ,在敏感品系中高表达的基因分别有 15个 (2～ 3倍 )和 9个 (3倍以上 )。对 3倍以上差异表达和特异表达基因进行单向测序 ,根据最高同源性比对结果 ,线粒体 r RNA基因、6 0 S核糖体蛋白基因、40 S核糖体蛋白 S4基因、胰蛋白酶前体基因、糜蛋白酶 A前体基因、视蛋白基因等在抗性品系中高表达 ;而 40 S核糖体蛋白 S2 9基因和肌球蛋白调控轻链 2在敏感品系中高表达 ;另外 ,1,4- α-葡聚糖分支酶和核糖体蛋白 46基因在抗性品系中特异表达。　结论　所获得的 13个差异表达基因和 2个特异表达基因与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性和敏感性相关     

大鼠脑卒中相关基因的抑制性差减杂交文库构建

建立寒冷加高盐刺激大鼠脑卒中的大脑组织差异cD NA文库。方法　正常Wistar大鼠随机分为寒冷加高盐刺激的实验组和不予任何处理的对照组。取实验组发生脑卒中和对照组的大脑组织。提取两组组织的mRNA ,按照抑制性差减杂交试剂盒说明进行实验。在三个水平设定了检验差减效率的实验。首先是使用试剂盒提供的骨骼肌mRNA加入外源性PhiX174(HaeⅢ )作为阳性实验组与我们的实验样品进行平行差减 ,用来证明系统正常。其次是采用PCR扩增看家基因GPDH的方法观察本次实验的差减效果。最后在两库随机各挑取 2 88个克隆测序 ,比较相同序列的重复情况。结果　差减各过程符合理论质量要求 ,分别得到一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。卒中库的理论容量是 7.1× 10 4 ,正常库的理论容量是 5 .5× 10 5。差减效率分析表明结果良好。结论　成功地建立了一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。为进一步深入研究该大鼠脑卒中模型的基因奠定了基础     

日本血吸虫毛蚴侵袭前后湖北钉螺差异表达cDNA文库的构建与分析

目的构建湖北钉螺被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后差异表达cDNA文库,筛选湖北钉螺免疫相关分子,为探讨病原与中间宿主的相互作用奠定基础。方法提取被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后湖北钉螺的头足部组织总RNA,纯化mR-NA,反转录合成cDNA。分别以被日本血吸虫毛蚴侵袭前湖北钉螺(未处理组)和被日本血吸虫毛蚴侵袭后湖北钉螺(处理组)的头足部组织作为检测方(Tester)和驱动方(Driver),利用PCR方法选择cDNA杂交试剂盒分别进行正向和反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T载体,重组质粒转入E.coliDH5α,对菌液用PCR法扩增鉴定其中的插入片段。随机抽取354个阳性克隆进行DNA序列分析,将所得表达序列标签(ESTs)序列在线进行BLAST分析。结果从正向文库随机挑取的354个阳性克隆中测得350个ESTs序列,生物信息学分析发现了34个湖北钉螺新基因,其中1个与已知基因部分同源。结论成功建立了被日本血吸虫侵袭前、后湖北钉螺差异表达片段cDNA消减文库,发现了湖北钉螺新基因,为筛选与湖北钉螺天然免疫相关的分子、进一步探讨中间宿主与病原的相互作用及筛选血吸虫病传播阻断疫苗候选分子奠定了基础。     

大鼠脑卒中相关基因的抑制性差减杂交文库构建

目的建立寒冷加高盐刺激大鼠脑卒中的大脑组织差异cDNA文库。 方法正常Wistar大鼠随机分为寒冷加高盐刺激的实验组和不予任何处理的对照组。取实验组发生脑卒中和对照组的大脑组织。提取两组组织的mRNA，按照抑制性差减杂交试剂盒说明进行实验。在三个水平设定了检验差减效率的实验。首先是使用试剂盒提供的骨骼肌mRNA加入外源性PhiX174（HaeⅢ）作为阳性实验组与我们的实验样品进行平行差减，用来证明系统正常。其次是采用PCR扩增看家基因GPDH的方法观察本次实验的差减效果。最后在两库随机各挑取288个克隆测序，比较相同序列的重复情况。 结果差减各过程符合理论质量要求，分别得到一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。卒中库的理论容量是7.1×10     

大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库的构建

目的构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库，为进一步筛选、克隆按蚊免疫差异新基因奠定基础。方法以大劣按蚊～约氏疟原虫为实验模型，分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊作为T组和D组，采用抑制差减杂交方法和T／A克隆技术构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库。结果扩增差减cDNA文库获得2500余个白色阳性克隆，随机挑取白色克隆进行PCR扩增。92％的克隆中均有200～600bp的插入片段，测序显示，有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆。结论成功构建了大劣按蚊差异基因文库。     

大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库的构建

目的构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊免疫差异新基因奠定基础。方法以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊作为T组和D组,采用抑制差减杂交方法和T/A克隆技术构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库。结果扩增差减cDNA文库获得2500余个白色阳性克隆,随机挑取白色克隆进行PCR扩增,92%的克隆中均有200～600bp的插入片段,测序显示,有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆。结论成功构建了大劣按蚊差异基因文库。     

马尔尼菲青霉酵母相消减cDNA文库的构建及初步筛选

目的构建马尔尼菲青零酵母相抑制性消减cDNA文库，寻找其在酵母相中的差异表达基因。方法分别提取马尔尼菲青零菌丝相和酵母相的总RNA并合成cDNA，然后应用抑制性消减杂交技术（SSH）。以酵母相为tester（检测子），菌丝相为driver（驱赶子），连接不同的接头，通过两轮杂交和两次抑制性PCR后，将产物与T载体连接并转染大肠杆菌。经PCR鉴定，共得到480条插入片段。序列分析和同源性比较表明一些基因与细胞壁抗原、转运蛋白、氧化还原酶等具有同源性。结果成功构建了一个以酵母相为tester（检测子）的抑制性消减cDNA文库。结论所构建的cDNA消减文库为进一步筛选马尔尼菲膏零致病相关基因奠定了基础。     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库.方法从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly(A)+ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中 457个克隆有插入片段,片段大小范围为 250～750 pb.结论应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库构建

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株(NS)与青蒿素抗性株(AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA,分别以NS为消减方(driver),AR为试验方(tester)及AR为driver,AS为tester进行双向抑制性消减PCR(SSHPCR)。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18T载体构建消减文库。　结果　NSAR和ARNS消减文库分别获得395个和506个阳性克隆,从NSAR和ARNS文库中随机挑取108个克隆PCR鉴定,分别有100个和104个含插入片段,大小在0.25～2kb之间。　结论　成功构建了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。     

溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库的构建

目的 构建溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。 方法 分别提取白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株（R-lab株）和敏感株（S-lab株）总RNA，纯化后获得mRNA，并反转录为双链cDNA。以R-lab株mRNA作为实验方（tester）， S-lab株mRNA作为驱动方（driver），以及R-lab株mRNA为driver方，S-lab株mRNA为tester方，进行正、反双向抑制性消减。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18-T载体， 构建白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性和敏感双向消减文库。 结果 分别从正向文库和反向文库中获得580和477个阳性克隆，从所构建文库随机挑选150个克隆进行PCR鉴定，阳性克隆率为93%，cDNA片段主要分布于150～750 bp。 结论 构建了抗溴氰菊酯白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。     

Identification of differentially expressed genes in normal mucosa, adenoma and adenocarcinoma of colon by SSH

Abbreviation CRC colorectal cancer.SSHsuppression subtrsctive hybridization.LD PCR longdistance polymerase chain reaction.HLA human leukocyteantigen.IGRBP insulin-like growth factor binding protein.GN guanylin,EF1 elongation factor 1AIM To construct subtracted cDNA libraries and furtheridentify differentially expressed genes that are related tothe development of colorectal carcinoma(CRC).METHODS Suppression subtractive hybridization(SSH)was done on cDNAs of normal mucosa,adenoma andadenocarcinoma tissues from the same patient.Threesubtracted cDNA libraries were constructed and thenhybridized with forward and backward subtracted probesfor differential screening.Positive clones from eachsubtracted cDNA library were selected for sequencing andBLAST analysis.Finally,virtual Northern Blot confirmedsuch differential expression.RESULTS By this way,there were about 3-4×10~2clones identified in each subtracted cDNA library,inwhich about 85% positive clones were differentiallyscreened.Sequencing and BLAST homology searchrevealed some clones containing sequences of knowngene fragments and several possibly novel genes showingfew or no sequence homologies with any knownsequences in the database.CONCLUSION All results confirmed the effectiveness andsensitivity of SSH.The differentially expressed genesduring the development of CRC can be used to shed lighton the pathogenesis of CRC and be useful genetic markersfor early diagnosis and therapy.     

Construction and analysis of SSH cDNA library of human vascular endothelial cells related to gastrocarcinoma

AIM: To construct subtracted cDNA libraries of human vascular endothelial cells (VECs) related to gastrocarcinoma using suppression substractive hybridization (SSH) and to analyze cDNA libraries of gastrocarcinoma and VECs in Cancer Gene Anatomy Project (CGAP) database. METHODS: Human VECs related to gastric adenocarcinoma and corresponding normal tissue were separated by magnetic beads coupled with antibody CD31 (Dynabeads CD31). A few amount of total RNA were synthesized and amplified by SMART PCR cDNA Synthesis Kit. Then, using SSH and T/A cloning techniques, cDNA fragments of differentially expressed genes in human VECs of gastric adenocarcinoma were inserted into JM109 bacteria. One hundred positive bacteria clones were randomly picked and identified by colony PCR method. To analyze cDNA libraries of gastrocarcinoma and VECs in CGAP database, the tools of Library Finder, cDNA xProfiler, Digital GENE Expression Displayer (DGED), and Digital Differential Display (DDD) were used. RESULTS: Forward and reverse subtraction cDNA libraries of human VECs related to gastrocarcinoma were constructed successfully with SSH and T/A cloning techniques. Analysis of CGAP database indicated that no appropriate library of VECs related to carcinoma was constructed. CONCLUSION: Construction of subtraction cDNA libraries of human VECs related to gastrocarcinoma was successful and necessary, which laid a foundation for screening and cloning new and specific genes of VECs related to gastrocarcinoma.     

Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.

A new and highly effective method, termed suppression subtractive hybridization (SSH), has been developed for the generation of subtracted cDNA libraries. It is based primarily on a recently described technique called suppression PCR and combines normalization and subtraction in a single procedure. The normalization step equalizes the abundance of cDNAs within the target population and the subtraction step excludes the common sequences between the target and driver populations. In a model system, the SSH technique enriched for rare sequences over 1,000-fold in one round of subtractive hybridization. We demonstrate its usefulness by generating a testis-specific cDNA library and by using the subtracted cDNA mixture as a hybridization probe to identify homologous sequences in a human Y chromosome cosmid library. The human DNA inserts in the isolated cosmids were further confirmed to be expressed in a testis-specific manner. These results suggest that the SSH technique is applicable to many molecular genetic and positional cloning studies for the identification of disease, developmental, tissue-specific, or other differentially expressed genes.     

日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达cDNA文库的构建和筛选

目的构建日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达基因的消减cDNA文库,并筛选差异表达基因。方法取日本血吸虫尾蚴经腹部感染小鼠致肝纤维化。采用抑制性消减杂交技术(SSH),分离小鼠肝星状细胞(HSC)及正常小鼠HSC,通过对比寻找差异表达基因。将其与T载体连接(T/A克隆),其产物转化大肠埃希菌DH5α,经文库扩增后,随机挑取白色克隆进行酶切鉴定,克隆经过正、反向杂交,阳性克隆经过测序和BLAST(局部相似性基本查询工具)进行表达序列标签(ESTs)差异基因分析。最后经模拟Northern印迹确认基因表达差异。结果扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆,随机挑取的克隆经酶切鉴定后均有200～600 bp插入片段。ESTs分析获得76个序列,其中70个序列提示与血吸虫病肝纤维化或与其相关的基因,6个在公共数据库中未找到同源序列片段。结论用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝纤维化小鼠HSC与正常小鼠HSC差异表达基因的消减cDNA文库。