一种β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因(BGL1)，为β-葡萄糖苷酶基因的表达作准备。方法：用PCR方法从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因连接到pGEM--T载体上，用限制性内切酶切下目的基因，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使之位于α-因子信号肽下游，且与之同框，构建成重组质粒pSHL9K。再将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行克隆，并进行鉴定。结果：重组pPIC9K转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母后，进行酶切和PCR鉴定，证明形成了目的基因的克隆。结论：应用大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母作为受体菌，pPIC9K为载体，成功克隆了β-葡萄糖苷酶基因。     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的克隆与分析

目的克隆辣根过氧化物酶同功酶C3(HRPC3)基因,为此基因的表达做准备。方法用PCR方法从辣根的基因组DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上。测序证明正确后,再以带有EcoRI和NotI酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因切下,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组pPIC9K质粒,用电转化转入毕赤酵母。提取转化子的基因组DNA,用PCR进行鉴定是否含有HRPC3基因。结果重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC3。     

大鼠谷氨酸脱羧酶(GAD)毕赤酵母表达重组子的构建

目的 :构建大鼠谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase,GAD)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子 ,探索一条真核细胞高效表达rGAD的新途径。方法 :以 pUC18_GAD质粒为模板PCR扩增出大鼠GAD65基因 ,将其克隆入PGEM_Teasy载体 ,继而将其克隆到毕赤酵母分泌型质粒表达载体 pPIC9K中 ,重组质粒线性化后PEG法转染入毕赤酵母菌株GS115,PCR筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了大鼠谷氨酸脱羧酶 (GAD)毕赤酵母表达重组子。结论 :为今后基因工程大量生产GAD抗原打下了基础     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达

目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定。EcoRI和NotI双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证。线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0．5％甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体。结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株。经过0．5％甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质。结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达。     

人骨形态发生蛋白-7成熟肽毕赤酵母表达重组子的构建

目的 :构建人骨形态发生蛋白 -7(bonemorphgeneticprotein -7,BMP -7)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子。方法 :以本室保存的重组质粒 pBV220/BMP -7为模板,经PCR扩增出人BMP -7成熟肽编码序列 ,先以A -T连接方式克隆入pGEM -Teasy载体,再将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9中,重组质粒线性化后PEG法转化入毕赤酵母菌株GS115,用PCR方法筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了人骨形成蛋白 -7(BMP -7)毕赤酵母表达重组子。结论 :为今后基因工程大量生产BMP -7打下基础。     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。     

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

 目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor, r-TF） 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组，构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF，利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115，转化子经 G418 抗性筛选后，获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导，表达 r-TF，表达产物经纯化后，鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物，纯化后，r-TF 经脂化后，具有促凝血活性，为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF，表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行，蛋白回收率高，纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。