雷帕霉素对未成熟树突状细胞RelB表达的影响研究

目的:研究雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)RelB表达的影响,为回输RAPA处理的imDC(RAPA-imDC)诱导移植耐受的机制研究提供实验依据。方法:分离诱导imDC、RAPA-imDC、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC),光镜和电镜观察其形态,流式细胞仪检测其CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,用免疫荧光法检测其RelB表达。结果:①电镜结果显示imDC与RAPA-imDC形态相似,呈未成熟状态,树突少、粗短;mDC树突较多,细长。②mDC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达显著高于imDC和RAPA-imDC(P<0.05);而imDC的表达也明显高于RAPA-imDC(P<0.05)。③免疫荧光法检测结果显示imDC、RAPA-imDC RelB表达量无显著变化,而mDC表达量高。结论:雷帕霉素能降低imDC表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,但对其RelB表达没有明显影响。     

成熟与未成熟小鼠树突状细胞的生物免疫学特性研究

目的 研究小鼠骨髓成熟树突状细胞(mDC)与未成熟树突状细胞(imDC)的生物免疫学特性.方法 体外诱导培养小鼠骨髓imDC,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激获得mDC.用小鼠CD11c免疫磁珠纯化DC.电镜观察DC的细胞形态.流式细胞术(FCM)检测细胞表面分子MHCⅡ、CD80、CD86的表达.用细胞增殖检测试剂(CCK-8)检测混合淋巴细胞反应(MLR)中DC刺激同种异基因T细胞的增殖能力.实时荧光定量PCR(QPCR)检测DC上细胞因子mRNA的表达.ELISA检测DC培养上清中的细胞因子表达.结果 电镜观察:imDC比mDC细胞突起少、短.胞质内有更多吞饮泡及溶酶体.FCM检测imDC上MHC-Ⅱ(27.2％)、CD80(27.6％)、CD86(29.5％)的表达水平均显著低于mDC MHC-Ⅱ(97.7％)、CD80(97.2％)、CD86(96.4％).MLR中相同反应比例imDC刺激T细胞的增殖能力,1∶5(1.63±0.04),1∶10(1.50±0.08),1∶20(1.28±0.07),1∶40(1.19±0.04),显著低于mDC 1∶5(2.21±0.09),1∶10(1.92 ±0.02),1∶20(1.64±0.01),1∶40(1.45±0.06),两组间差异均有统计学意义(均P＜0.01).QPCR检测imDC上IL12p35(0.66±0.13)、IL12p40(0.57±0.10)、IFN-γ(0.74±0.08)mRNA相对表达量(mDC为对照)显著低于mDC(1.00±0.00,P＜0.05),而TGF-β(1.35±0.09)显著高于mDC(1.00±0.00,P＜0.05).ELISA法检测imDC分泌IL12p70(6 ±4)、IFN-γ(56±15)显著低于mDC IL12p70(120±22)、I FN-γ(90±15,P＜0.05),而TGF-β(176±23)显著高于mDC TGF-β(55±18,P＜0.05).结论 imDC低表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,高表达TGF-β,不能活化T细胞,具有耐受原性.mDC高表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,可激活初始T细胞,具有免疫原性.     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells, DC)分享、培养、鉴定的方法.方法 重组大鼠rGM-CSF、 rIL-4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs, DCs经形态学观察、表型检测、功能学鉴定.结果 大鼠骨髓来源的DC在体外9d后完全成熟,90%以上培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62,高表达MHCII、 CD80、 CD86成熟的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 成功地建立了体外大鼠骨髓DC扩增的方法.     

大鼠骨髓来源树突状细胞外泌体的提取及功能研究

目的:探讨在不同成熟状态下树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌的外泌体(exosomes,Dex)的制备、提取及体外功能鉴定。方法:F344大鼠骨髓来源DC培养6后分为2组,一组为未成熟树突状细胞组(immature DC,imDC):直接收集上清;一组为成熟树突状细胞组(mature DC,mDC):每孔加入终浓度为1μg/ml的LPS培养48h后,收集上清。然后用多步离心法分离得到Dex,流式细胞术检测两组Dex的表型,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测两组Dex与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养上清的白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12p70)的含量,混合淋巴细胞实验(MLR)检测共培养DCs刺激T细胞增殖能力。结果:与mDC分泌的exosomes相比,imDC分泌的exosomes表面中度表达MHC-Ⅱ类分子、低表达CD80、CD86、CD40共刺激分子,而且与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养后刺激IL-12p70分泌能力较低(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖的能力也较mDC分泌的exosomes组弱(P<0.05)。结论:不同成熟状态下的DC分泌...     

一种简便、高效的大鼠树突状细胞的分离方法

目的寻求一种简便、高效的大鼠骨髓树突状细胞(DC)分离与培养的方法。方法处死F344大鼠1只,消毒,取四肢骨,剔除肌肉,剪去骨两端;培养基冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,经密度梯度离心得到淋巴单核细胞,加入全RPMI 1640培养基和rrGM-CSFr、rIL-4,培养箱中培养;经倒置显微镜、电镜观察细胞形态,经流式细胞仪鉴定DC纯度,显微镜下细胞计数。结果第4天经倒置显微镜、电镜观察DC出现典型形态;流式细胞仪检测第4天OX62阳性率为8.92%、MHC-Ⅱ为20.9%、CD86为16.98%;第8天OX62阳性率为58.07%、MHC-Ⅱ为60.49%、CD86为62.94%;第15天OX62阳性率为84.68%、MHC-Ⅱ为88.03%、CD86为62.80%。显微镜下细胞计数DC数量为(1.0~2.0)×107。结论应用梯度分离加细胞培养分离纯化大鼠DC,其纯度较高(80%以上),数量大[(1.0~2.0)×107]。     

骨髓、脾脏、淋巴结来源间质干细胞免疫调节作用的比较

目的探讨骨髓、脾脏和淋巴结来源间质干细胞(MSC)免疫调节能力的差异,筛选更适合治疗免疫相关疾病的MSC来源。方法分离同一供者来源的脾脏、骨髓、淋巴结的MSC,利用诱导分化体系验证其成骨成脂成软骨分化潜能,通过流式细胞术检测表面标记物;同时构建MSC与T细胞共培养体系,并检测MSC的免疫调节能力。结果成功分离并培养了骨髓、脾脏和淋巴结来源的MSC,3种MSC均为成纤维样细胞形态,贴壁生长,流式检测发现3种MSC均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166(均98%),不表达CD34、CD45(均1%);在体外特定诱导条件下3种MSC均具有成骨成脂成软骨分化潜能。通过与T淋巴细胞共培养实验发现脾脏来源的MSC(SP-MSC)、淋巴结来源的MSC(LN-MSC)及骨髓来源的MSC(BM-MSC)均能有效抑制T细胞增殖,CD4+T细胞增殖的比例分别为:单独T细胞:(53.69±2.96)%,BM-MSC:(35.62±2.61)%,SP-MSC:(23.54±2.35)%,LN-MSC:(2.92±0.35)%,也能抑制T细胞分泌炎性因子,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌水平分别下降为:单独T细胞:(57.57±1.71)%,BM-MSC:(22.88±1.37)%,SP-MSC:(14.85±1.37)%,LN-MSC:(12.67±1.37)%;干扰素-γ(IFN-γ)分泌水平分别下降为:单独T细胞:(15.42±1.09)%,BM-MSC:(9.49±0.28)%,SP-MSC:(2.59±0.28)%,LN-MSC:(2.05±0.28)%,且SP-MSC和LN-MSC的抑制效果均优于BM-MSC。结论成功分离脾脏、淋巴结、骨髓的MSC,且脾脏、淋巴结来源的MSC的免疫调节能力优于骨髓来源的MSC,有望为免疫相关疾病的治疗提供更合适的MSC。     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定。方法根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7d和14d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况。结果新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形,胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低。诱导分化7d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则;MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低。诱导分化14d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态;MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0%~86.2%。结论密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法。     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的 建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定.方法 根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30 ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7 d和14 d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况.结果 新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形, 胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低.诱导分化7 d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则; MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低.诱导分化14 d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态; MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0% ～86.2%.结论 密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF+IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法.     

大鼠骨髓树突状细胞的体外分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的方法并对其生物学特性进行研究.方法 应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导培养从大鼠管状骨中提取的骨髓细胞5 d后,将细胞分成脂多糖(LPS)刺激组和未刺激组(对照组),48 h后进行形态学观察,用流式细胞仪检测组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)和CD80的表达,用ELISA法测定培养上清中IL-6和IL-12的含量.结果 培养的大鼠骨髓细胞具有树突状突起,具有DC的典型形态.培养7 d后,对照组MHC-Ⅱ、CD80表型表达阳性率分别为5713%和29.1%,LPS刺激组MHC-Ⅱ、CD80表型表达阳性率分别为70.9%和73.5%;LPS刺激组IL-6和IL-12含量高于未刺激组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功建立了大鼠DC体外分离培养和诱导成熟的方法;在分化成熟过程中,DC在表型和细胞因子分泌功能上均发生了变化.     

Lewis大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和鉴定

目的建立从Lewis大鼠骨髓中分离、培养间充质干细胞的方法,并对分离、培养的间充质干细胞进行鉴定.方法采用Percoll（1.073g/L）密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离培养Lewis大鼠的骨髓间充质干细胞（MSC）.MSC细胞鉴定：采用相差显微镜观察MSC的形态学特征;流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD29,CD90,CD34和CD45的表达率;苏丹Ⅳ染色检测MSC成脂细胞分化;碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测MSC成骨分化.结果原代培养的MSC于24 h后贴壁,48～72 h形成集落,12～15 d可达到80%～90%融合.第1代细胞表面标记物CD29,CD90,CD34和CD45的阳性率分别为80.41%,66.27%,2.73%,0.74%.第3代细胞表面标记物CD29,CD90,CD34和CD45的阳性率分别为89.91%,88.17%,0.81%,0.17%.细胞周期分析显示,第5代细胞G0/G1期细胞占68.9%,S＋G2＋M期为31.1%.用α-MEM培养液培养的第6代细胞部分分化为成骨和成脂细胞.结论采用Percoll（1.073g/L）密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养大鼠的MSC.第5代MSC细胞保持分化潜能.     

骨髓基质干细胞接种于纤维蛋白凝胶的体外培养

目的：研究经分离培养的免音舱基质子细胞(MSC)接种在可吸收性纤维蛋白凝胶上向成分细胞分化，表型维持的影响。方法：取兔骨髓基质子细胞于含100nl/L胎牛血清的DMEM培养液中培养，并向成管细胞诱导。将细胞与纤维蛋白凝胶复合，通过扫描电镜观察细胞附着情况，共聚焦显微镜观察I型胶原的分泌，组织化学染色检测碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞，ALP含量测定。结果：骨髓基质子细胞在可吸收性纤维蛋白凝胶表面附着良好并继续增殖，可分泌I型胶原，这些细胞的ALP染色呈强阳性，细胞碱性磷酸酶含量增高。结论：具有良好的可塑性、低抗原性、好的降解吸收性的纤维蛋白凝胶具有促进骨髓基质细胞表达成管细胞表型、合成细胞外基质的功能，是良好的细胞载体。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病患者骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 研究骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)患者的骨髓间充质干细胞(MSC)的生物学特性.方法 获取7例MDS和21例AML患者的骨髓标本,以6例正常成人的MSC为对照组.体外分离、培养和扩增MSC,显微镜观察MSC的形态和生长特性,免疫细胞化学染色和流式细胞计数进行表型鉴定,RT-PCR法检测MS...     

成鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分化为神经前体细胞的可能性.方法:MSC原代培养、传代后在细胞因子和氧化剂作用下进行诱导.形态学观察,免疫细胞化学、流式细胞分析和细胞电生理检查.结果:MSC体外可诱导为神经前体细胞,诱导后有表面抗原nestin表达,5 h分化率49.8%,同时具有早期神经干细胞电流特性.结论:骨髓来源的神经前体细胞治疗中枢神经系统疾病成为可能.     

不同来源的人间质干细胞分离与基本生物学特性研究

目的：分离并比较人胚胎骨髓、成人骨髓和新生儿脐血来源间质干细胞（MSC）的生物学特性,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法： 用贴壁方法分离三种来源的间质干细胞,观察其形态与生长曲线,并用流式细胞仪测定其表面标志.结果： 骨髓标本均可成功分离出MSC,但是人胚胎骨髓MSC增殖能力要明显强于成人骨髓MSC,而脐血分离MSC没有得到成功.结论： 人胚胎骨髓MSC是很好的组织工程种子细胞,成人骨髓MSC的增殖能力相对较弱,应用受到一定的限制.脐血MSC分离与扩增有待进一步研究.     

小鼠骨髓基质干细胞的培养及常见的组化染色方法

目的:研究小鼠骨髓基质干细胞的培养条件及其成为组织工程种子细胞的可能性.方法:取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察,了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点.结果:刚接种的干细胞散在分布,胞体透亮,1～2 d后开始贴壁,1周后开始形成成纤维细胞样集落,大约2周长成单层,碱性磷酸酶染色阳性,细胞可分泌胶原,可形成钙结节.结论:小鼠骨髓基质干细胞可在体外进行培养增殖并具有组织工程种子细胞的特点.     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及生长特性的初步研究

目的:探索兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离及培养扩增的方法。方法:骨髓穿刺法抽取雄性新西兰白兔髂骨骨髓5ml,联合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化MSC并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态。结果:成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法,生长动力学分析发现,传代细胞随传代次数的增加,增殖能力逐渐下降。结论:兔MSC能在体外成功培养、扩增,可作为组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程理建中种子细胞的可能性。方法;采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养,并研究其增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示,兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖增能力。结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻,用作半月板组织工程 种子细胞具有较强的可行性。     

间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的形态学观察

目的：探讨以间质干细胞（MSC）与同种异体脱钙骨复合培养法构建组织工程化生物衍生骨的可行性。方法：预先制备同种异体脱钙骨，取健康成人骨髓，用单核细胞分离液分离MSC，间充质干细胞基础培养基原代和传代培养。倒置显微镜下观察细胞生物学特性，用FITC标记的抗CD105对第3例细胞进行流式细胞鉴定，并与同种异体脱钙骨复合培养1周后行扫描电镜观察。结果：原代及传代培养的MSC增殖迅速，第3代CD105阳性细胞占64．1％，复合同种异体脱钙骨培养1周后细胞生长状态良好，增殖迅速，在材料表面形成细胞层。结论：未诱导的MSC是骨组织工程适宜的种子细胞，与同种异体脱钙骨复合可作为骨组织工程的载体。