Noggin基因对成年大鼠海马神经前体细胞增殖的影响

目的 探讨noggin基因对成年海马BrdU标记细胞的调控。方法 原位杂交与RT-PCR检测noggin基因在海马的表达，免疫组化检测BrdU标记细胞数，反义技术阻断内源性noggin基因表达。结果 侧脑室注射反义寡核苷酸后，成年大鼠海马内noggin mRNA阳性细胞数明显降低，而BMP4mRNA阳性细胞数无明显变化，同时大鼠海马齿回及齿回颗粒下区的BrdU阳性细胞数均较正常对照组明显降低，正义寡核苷酸无此效应。结论 内源性noggin可促进成年内海马神经前体细胞的增殖。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

成年大鼠海马神经前体细胞的体外培养及诱导分化

目的 建立成年大鼠海马神经前体细胞的体外培养方法并探讨其生物学特性。方法 使用加入bFGF(20ng／ml)的无血清培养基培养成年大鼠海马神经前体细胞，MTT法检测细胞生长曲线．BrdU标记和免疫荧光化学方法观察培养细胞生物学特性。结果 加入bFGF培养的成年大鼠海马组织细胞可表达Nestin，具有稳定连续的克隆增殖能力。经诱导分化后的细胞可表达神经元和胶质细胞的特异性标志物。结论 本实验分离的培养细胞具有可在体外稳定自我复制、大量增殖和多向分化潜能的特点．是理想的神经前体细胞。     

电针穴位刺激对致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为学变化影响的实验研究

目的:观察电针刺激百会穴对锂-匹罗卡品诱导致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为的影响,为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.方法:选用锂-匹罗卡品诱导致痫成年大鼠模型,采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较致痫后7,14,42 d时电针刺激穴位干预致痫组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度,并同时观察动物行为学改变.结果:电针穴位刺激后,明显促进了大鼠致痫后7 d,14 d时齿状回的神经发生水平,BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加(P<0.01),而致痫后第42日时两组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异(P＞0.05).同时,电针穴位刺激干预组大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠.结论:电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变,即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化.     

ES细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后的分化及对学习记忆的改善

目的 观察来源于小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞移植Aβ海马损伤大鼠后的存活、分化以及细胞移植对模型大鼠的治疗作用.方法 采用改良的无血清方法将表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞,移植至单侧海马注射Aβ1-40损伤模型大鼠注射处;免疫荧光双染观察移植细胞的存活、分化.结果 胚胎体在改良的N3选择性培养基生长5 d后,90%以上的小鼠胚胎干细胞分化为nestin阳性神经前体细胞.移植到模型大鼠海马后神经前体细胞存活良好,EGFP荧光显示移植细胞呈集落生长,Cy3荧光显示大部分细胞分化为GFAP阳性细胞,移植区周围可见一定数量NF200阳性细胞,其中部分发出类似神经元的长突起.行为学结果显示移植大鼠记忆能力较对照组明显改善.结论 胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ1-40损伤模型大鼠海马后能有效存活,大部分移植细胞分化为胶质细胞,小部分分化为神经元,细胞移植能改善模型大鼠学习记忆功能障碍.     

caspase-3在海马损伤后齿状回神经发生调控中的作用

目的探讨成年大鼠海马CA1区损毁后,齿状回（DG）细胞先增殖后减少的原因。方法用海人酸（KA）建立单侧海马损毁模型;用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记海马DG区增殖的细胞,用免疫组织化学方法检测标记后不同时间点DG区BrdU阳性细胞,并用无偏差体视学方法定量分析;激光共聚焦显微镜检测BrdU与裂解的caspase-3的共表达。结果实验组动物在损毁海马后各时间点DG区BrdU阳性细胞总数均比对照组明显增多,差异有统计学意义（P〈0.05）;各组动物BrdU阳性细胞总数在标记后第1天最多,随着时间的延长逐渐减少;在颗粒细胞层和门区均有少量BrdU/cleaved caspase-3共表达的阳性细胞。结论损毁成年大鼠海马CA1区后,增殖的细胞总数随着时间的延长逐渐减少,其机制可能与caspase-3相关的细胞死亡及异位迁移有关。     

自噬在海马损伤后齿状回神经发生调控中的作用

目的探讨成年大鼠单侧海马CA1区毁损后,海马齿状回（DG）神经发生新生细胞存活与自噬的关系。方法建立海人酸（KA）损毁单侧海马的模型,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）于毁损后3d标记增殖的细胞,免疫组织化学检测BrdU阳性细胞,采用体视学的计数方法计算DG的BrdU阳性细胞总数。用自噬特异性抗原微管相关蛋白轻链3（LC-3）与BrdU双标的方法检测这些新生细胞的减少是否有自噬的参与。结果假毁损组DG区可见少量的BrdU阳性细胞;与假毁损组比较,实验组在海马毁损后DG区BrdU阳性细胞明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）,在BrdU给药后第1天最多,随着时间的推移逐渐减少,各组之间差异有统计学意义（P〈0.05）;各时间点均未见BrdU和LC-3双标细胞。结论成年大鼠海马毁损可增强DG的神经发生,新生细胞随着时间的推移逐渐减少,而自噬性程序性细胞死亡在新生细胞减少的调控中可能不占主导作用。     

黄芪甲苷对短暂性前脑缺血模型大鼠海马神经再生的影响

目的 观察黄芪甲苷对短暂性前脑缺血大鼠海马神经干细胞增殖、分化的影响,探讨其促进神经发生和分化的作用。方法 雄性 SD 大鼠随机分为假手术组,模型组,黄芪甲苷高、低剂量组 (4、2 mg/kg),每组10只。短暂性前脑缺血后黄芪甲苷 ip 给药,模型组和假手术组 ip 给予生理盐水,1 次/d,ip BrdU 10 mg/kg,2 次/d,标记增殖细胞。各组分别于第7、14天后取脑组织,冰冻切片,行 BrdU 免疫荧光染色显示海马区域增殖的细胞,BrdU 与MAP-2,GFAP 等免疫荧光双标染色显示海马区域干细胞来源的成熟神经细胞和星形胶质细胞;取海马组织,Real Time RT-PCR 法检测基本成纤维细胞生长因子 (bFGF)、神经生长因子 (NGF)、脑源神经营养因子 (BDNF)、血管内皮生长因子 (VEGF) mRNA 的表达。结果 黄芪甲苷高、低剂量,作用 7 d 后,可增加海马 DG 和 CA1 区 BrdU 阳性细胞数量和海马 CA1 区 BrdU/GFAP 阳性细胞数量;作用 14 d 后,可显著增加海马 DG 区 BrdU/MAP-2 双阳性细胞数量。其中,黄芪甲苷低剂量 (2 mg/kg) 作用 7 d 后可显著上调 NGF mRNA 表达。结论 黄芪甲苷能够促进海马区神经干细胞增殖、分化,很可能与其上调 NGF mRNA 表达有关。     

切割海马伞海马对神经干细胞的存活、迁移和分化的影响

目的 :观察成鼠神经干细胞 (NSCs)移植入切割海马伞侧和正常侧海马后存活、迁移和分化的情况 ,以及切割海马伞提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用。方法 :用无血清培养和单细胞克隆技术获得成年SD大鼠前脑室下区NSCs ,BrdU标记扩增。切割SD大鼠右侧海马伞 ,术后 2周将标有BrdU的NSCs植入双侧海马齿状回。术后不同时期行Nissl染色、BrdU免疫荧光、β -tubulin -Ⅲ /BrdU免疫组化双重染色和AChE组化染色。同时在体外将NSCs种植于 2 4孔培养板中 ,分成三组 :切割组和正常组分别加入切割海马伞侧和正常侧海马提取液。结果 :各时期移植区中均有大量BrdU阳性细胞 ;BrdU阳性细胞沿海马齿状回颗粒下层迁移 ,并在颗粒下层内形成迁移条带 ;各时期切割侧齿状回中BrdU阳性细胞密度大于正常侧 ;切割侧齿状回中较正常侧有较多Nissl深染大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞 ;切割侧海马齿状回见数个 β -tubulin -Ⅲ /BrdU双标神经元和AChE阳性神经元。与正常组相比 ,切割组MAP -2和AChE阳性神经元数量多、分化好。结论 :移植到海马中的NSCs能存活、迁移并分化为神经元 ,切割海马伞侧海马中某些物质表达增强可促进NSCs向神经元或AChE阳性神经元分化     

单侧海马损毁诱发双侧齿状回细胞增殖的研究

目的探讨成年大鼠单侧海马锥体细胞被损毁后,海马齿状回(dentategyrus,DG)神经干细胞/前体细胞(neuralstemcells/progenitorcells)原位激活的时间变化规律。方法用海人酸(kainicacid,KA)建立单侧海马损毁模型,用5溴脱氧尿嘧啶核苷(5bromodeoxyuridine,BrdU)标记增殖的细胞,免疫组织化学染色检测损毁后不同时间点损毁侧及对侧海马DG表达BrdU的细胞数。结果空白对照组和各时间点假损毁组双侧海马DG区均可见到少量BrdU阳性细胞,组间无显著性差异(P>0.05);与对照组比较,实验组双侧DGBrdU阳性细胞均于损毁后第3d起明显增多(P<0.01),第5d达高峰(P<0.01),第9d下降至对照组水平;损毁侧阳性细胞数目较对侧略多。结论成年大鼠单侧海马损毁可增强双侧海马DG的神经发生,其机制可能与损毁引起的机体激素水平、神经递质、神经营养因子浓度的改变以及损毁侧局部微环境变化有关。     

大鼠癫癎持续状态后海马神经元凋亡的研究

目的：通过美解眠诱导鼠癫癎持续状态后观察海马神经元的细胞凋亡现象。　材料和方法：给ＳＤ大鼠腹腔注射美解眠（２０ ｍ ｇ／ｋｇ）,２４ ｈ 后在光镜和电镜下观察大鼠海马神经元的形态学改变,并以ＤＮＡ 末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测海马神经元的凋亡。　结果：ＳＤ大鼠注射美解眠后出现典型的癫癎发作,光镜和电镜下可观察到海马神经元有典型的细胞凋亡现象,包括细胞体皱缩、胞质浓缩、染色质凝聚成块状、有边集现象, 同时有少量凋亡小体形成。ＴＵＮＥＬ检测发现海马结构内可见ＴＵＮＥＬ染色阳性细胞,其分布不均匀,有区域性差异,以ＣＡ３ 区最为多见。致癎组海马ＣＡ３ 区ＴＵＮＥＬ阳性细胞数的平均百分率（７５．１４％ ）与对照组（９．４％ ）相比有极显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）。　结论：癫癎发作可诱导大鼠海马神经元发生凋亡。     

JNK抑制剂SP 600125对癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用

目的：探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）特异性抑制剂SP600125对大鼠癫痫持续状态海马神经元的保护作用及其作用机制。方法 Wistar大鼠按随机数字表随机分为对照组（Control组）、癫痫持续状态组（ SE组）和JNK抑制剂SP600125组（ SP组）。应用HE染色和荧光TUNEL法观察各组大鼠海马病理变化和神经元凋亡;采用Western blot方法检测各组大鼠海马组织JNK及其下游效应分子c-JUN磷酸化表达变化。结果与对照组相比,SE组大鼠海马CA3区神经元细胞缺失、凋亡明显[（ TUNEL阳性细胞百分率（26．34±3．04）％, P＜0．05];SP组较SE组大鼠死亡率明显下降（分别为6．25％、37．5％,P＜0．05）,细胞缺失和凋亡明显减少[TUNEL阳性细胞百分率分别为（7．48±1．37）％、（26．34±3．04）％, P＜0．05];同时,SE组大鼠海马磷酸化JNK（p-JNK）和磷酸化c-JUN（p-c-JUN）显著增加（OD相对值分别为0．447±0．025、0．552±0．035,与对照组相比, P＜0．05）,应用SP600125的SP组JNK和c-JUN的磷酸化水平明显下降（OD相对值分别为0．211±0．016、0．237±0．028,与SE组相比, P＜0．05）。结论 JNK抑制剂SP600125通过抑制JNK及c-JUN磷酸化水平对癫痫持续状态后大鼠海马神经元起到保护作用。     

氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠癫痫持续状态神经元凋亡反应的年龄特征

目的探讨氯化锂-匹罗卡品诱发癫痫持续状态(statusepilepticus,SE)后大鼠脑内神经元凋亡过程及Caspase3活性的年龄特征。方法氯化锂-匹罗卡品诱发幼年及成年Wistar鼠持续惊厥发作,比较惊厥发作严重程度的年龄差异,应用原位末端标记、流式细胞仪和荧光分光光度法测定惊厥后脑组织神经细胞凋亡的动态变化及Caspase3活性变化,比较研究其年龄差异特征。结果幼年鼠从给药至惊厥发作的时间为(13.3±5.63)min,而成年鼠为(22.5±5.66)min;幼年鼠的首发SE中4～5级者占68%,而成年鼠仅18%;尽管SE前幼年鼠脑内凋亡细胞数较成年鼠“生理性”增多,但SE后30min,成年鼠脑内(海马CA3区、齿状回、颞叶皮层)TUNEL阳性细胞总数即已明显增多并反超幼龄鼠,分别达524±26和465±26(P<0.05)。即使连续观察到SE后8h,成年鼠脑内凋亡细胞计数也始终明显高于幼年鼠。经流式细胞仪检测的凋亡早期神经细胞也呈现相似变化。与幼龄鼠相比,成年鼠不仅Caspase3活性增高的幅度大,且启动时间早。SE后仅30min,成年鼠海马中Caspase3活性增加的比例已明显超过幼年鼠,分别为0.1±0.07和0.003±0.04。SE后2h,两者差别更大,分别为0.39±0.2和0.1±0.2。结论由氯化锂-匹罗卡品诱发的惊厥持续状态模型再次证实SE发作中未成熟脑内呈现一个主动抑制细胞凋亡进程、对抗惊厥性脑损伤的保护性机制,并提示该保护机制作用于Caspase3级联反应被激活前的细胞凋亡早期事件中。     

PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF NEURAL STEM CELLS IN ADULT RATS AFTER CEREBRAL INFARCTION

Objective To investigate proliferation and differentiation of neural stem cells in adult rats after cerebral infarction. Methods Models of cerebral infarction in rats were made and the time-course expression of bromodeoxyuridine (BrdU), Musashil, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and neuronal nuclear antigen (NeuN) were determined by immunohistochemistry and immunofluorescence staining. BrdU and Musashil were used to mark dividing neural stem cells. GFAP and NeuN were used to mark differentiating neural stem cells. Results Compared with controls, the number of BrdU-labeled and BrdU-labeled with Musashil-positive cells increased strikingly 1 day after cerebral infarction; approximately 6 fold with a peak 7 days later; markedly decreased 14 days later, but was still elevated compared with that of controls; decling to the control level 28 days later. The number of BrdU-labeled with GFAP-positive cells nearly remained unchanged in the hippocampus after cerebral infarction. The number of BrdU-labeled with NeuN-positive cells increased strikingly 14 days after cerebral infarction, reached maximum peak in the hippocampus 28 days after cerebral infarction in rats. Conclusion Cerebral infarction stimulate proliferation of inherent neural stem cells and most proliferated neural stem cells differentiate into neurons.     

脑梗死后自体神经干细胞原位增殖与分化的实验研究

目的研究成年大鼠脑梗死后自体神经干细胞的原位增殖和分化。方法雄性Wistar大鼠共112只,分对照组(12只)、脑梗死后1d组(20只)、脑梗死后3d组(20只)、脑梗死后7d组(20只)、脑梗死后14d组(20只)、脑梗死后28d组(20只)。大鼠于不同的时间处死,并取出大脑,处死前均注射5-溴胱氧腺苷嘧啶(BrdU)。用免疫组织化学方法动态检测BrdU、Musashil、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核性蛋白(NeuN)的表达。BrdU、Musashil确定神经干细胞的增殖,GFAP、NeuN确定神经干细胞的分化。结果与对照组相比,大鼠海马BrdU^ 细胞和BrdU^ ／Musashil^ 细胞数在脑梗死后1d组开始增加,7d组达到高峰,28d组接近正常水平;BrdU^ ／GFAP^ 细胞数无明显变化;BrdU^ ／NeuN^ 细胞数在脑梗死后14d组开始增加,28d组最多。结论大鼠脑梗死激活自体神经干细胞原位增殖,并且大多数增殖的神经干细胞分化成神经元。     

Voluntary exercise promotes proliferation and differentiation of adult rat hypothalamus progenitor cells

目的探讨自主运动对大鼠下丘脑神经细胞增殖与分化的影响。方法雄性Wistar大鼠,随机分为对照组（SE）和自主运动
组（EX）,以上两组又进一步分为6、13、23、33、43、53 d共6个亚组。各组大鼠从实验开始,连续5 d腹腔注射BrdU,于上述时间
点处死大鼠并取脑组织观察下丘脑的BrdU阳性细胞数的变化。结果免疫组化结果表明,EX组下丘脑的BrdU阳性细胞数在
23、33、43、53 d亚组中明显高于SE组（P<0.05）。EX组中经43 d的自主运动后,BrdU阳性细胞数与神经元双染色细胞数明显增
加（P<0.05）,对照组各亚组则无显著性变化。结论自主运动可促进下丘脑的神经祖细胞增殖并分化为神经元,这可能与长期
的运动锻炼有一定关系。
     

加味圣愈汤对大鼠脑外伤后神经细胞凋亡的影响

目的:研究加味圣愈汤对脑外伤大鼠海马结构神经细胞凋亡的影响,探讨其抑制创伤性脑损伤后继发性脑损伤的作用机制。方法:采用改良的Feeney法建立脑外伤模型,将动物随机分为假手术组、脑外伤组、加味圣愈汤治疗组。72h处死后行尼氏染色,光镜下观察损伤侧海马细胞形态并计数,分别用凋亡细胞原位末端标记(TUNEL)法和免疫组织化学法观察海马神经细胞凋亡及凋亡相关基因caspase-3的蛋白表达情况。结果:加味圣愈汤治疗组与脑外伤组比较,损伤侧海马神经细胞损害减轻,细胞数明显增加,神经细胞凋亡减少,caspase-3表达减少(P<0.01)。结论:加味圣愈汤治疗可减轻脑外伤后的继发性损伤,其机制可能与抑制caspase-3的表达,减少TBI后神经细胞的凋亡有关。     

电针预处理抑制癫痫持续状态诱发的海马区神经元凋亡研究

目的：观察电针预处理对癫痫持续状态（status epilepticus,SE）诱发的海马区神经元凋亡的影响。方法：20只SD大鼠被随意分为4组：对照组、癫痫组、电针组、电针对照组,电针组和电针对照组给予电针预处理3周后,按经典方法建立锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型,用TUNEL法及免疫荧光法观察海马区神经元的凋亡。结果：（1）与对照组比较,癫痫组和电针对照组海马CA1/CA3区TUNEL及Caspase-3阳性的神经元明显增多（P〈0.01,n=5）;（2）与癫痫组和电针对照组相比,电针预处理减少了海马CA1/CA3区TUNEL及Caspase-3阳性神经元的数量（P〈0.05,n=5）。结论：电针百会及大椎穴预处理,可以减低SE诱发的海马区神经元的凋亡。     

对大鼠脑缺血再灌注后tTG表达的影响

目的   研究胱氨酸（Cystamine）对全脑缺血再灌注损伤后大鼠海马组织型转谷氨酰胺酶（tTG）表达的影响。方法    用四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型。将SD大鼠随机分为假手术组（n=8）,全脑缺血组（n=48）及全脑缺血治疗组（n=48）,全脑缺血组和全脑缺血治疗组按照缺血再灌注时间点的不同再将大鼠随机分为6h、12h、1d、3d、5d、7d六个亚组,每个亚组8只。全脑缺血治疗组大鼠给予Cystamine腹腔注射（0.15mg/g）,全脑缺血组和假手术组大鼠给予生理盐水腹腔注射。TUNEL染色法观察细胞凋亡水平的变化,免疫组织化学方法分析再灌注后不同时间点海马CA1区tTG表达水平的变化。另取52只大鼠随机分为假手术组（n=4）、全脑缺血组（n=24）及全脑缺血治疗组（n=24）,全脑缺血组和全脑缺血治疗组按照不同时间点每个亚组4只,免疫印迹方法测定tTG的表达。结果   缺血组再灌注24h后TUNEL阳性细胞明显增加,1、3、5、7d亚组与假手术组差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组与缺血组相比,在1、3、5、7d相应时间点亚组TUNEL阳性细胞数减少（P<0.05）。治疗组海马CA1区tTG平均阳性细胞数于全脑缺血后12h开始下降,3、5、7d亚组均明显低于缺血组（P<0.05）。治疗组海马tTG蛋白水平于缺血再灌注后1d开始降低,3、5和7d亚组显著低于缺血组（P<0.05）。结论   Cystamine可以降低大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区tTG的表达,从而对神经元细胞起到一定的保护作用。