分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM),3’端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重PCR及荧光PCR分型方法的建立与评价

目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用

目的 建立结核分枝杆菌的分子信标荧光定量PCR检测方法 ,探讨该方法 检测结核分枝杆菌的临床应用价值.方法 针对结核分枝杆菌Ag85B DNA特异保守序列设计引物和分子信标探针,并构建标准品.采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法检测158例肺结核患者痰液标本,比较3种方法 的检出率.结果 所建立方法 最低检测限度为2个基因拷贝/反应,在2×10~2～2×10~8基因拷贝/mL范围内,Ct值同DNA量的对数呈线性关系.该方法 检测5株非分枝杆菌和6株非结核分枝杆菌结果 均为阴性,检测结核分枝杆菌H37Rv出现75 bp特异条带.分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法阳性检出率分别为60.13%、16.46%、31.01%,荧光定量PCR法检出率明显高于抗酸染色法和集菌培养法.结论 分子信标荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的诊断有一定的临床意义.     

分子信标实时PCR检测瘢痕相关p53基因SNP方法的建立

目的建立分子信标实时PCR检测病理性瘢痕相关p53基因第72密码子单核苷酸多态性的新方法。方法采集瘢痕疙瘩患者外周血28例,提取DNA并用分子信标PCR检测p53基因多态性。设计一对p53基因第72密码子单核苷酸多态性荧光分子信标探针,荧光定量PCR检测该位点单核苷酸(SNP),并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。结果定量荧光PCR荧光分子信标检测的结果与测序结果吻合率达到100%,高于反向斑点杂交法且简便快捷。结论分子信标实时PCR检测技术适合临床p53基因第72密码子单核苷酸多态性快速诊断。     

甲型副伤寒杆菌pagC基因分布及其重组表达产物免疫保护作用

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯表达的rPagC。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测rPagC表达情况及其产量。采用免疫扩散法、ELISA和Western Blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rPagC对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护效果,微量肥达试验检测rPagC免疫小鼠血清凝集伤寒和副伤寒沙门菌的效果。结果:所有被检测的甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带pagC基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.1%～100%和98.4%～100%。所构建的原核表达系统能高效表达rPagC。rPagC免疫家兔可产生高效价抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。ELISA结果显示,97.1%(66/68)甲型副伤寒患者血清标本rPagC抗体阳性。100μg和200μg rPagC对感染小鼠的免疫保护率分别为73.3%(11/15)和86.7%(13/15)。rPagC免疫小鼠血清对甲型副伤寒沙门菌和伤寒沙门菌H抗原凝集效价高达1∶10～1∶40。结论:pagC基因在甲型副伤寒沙门菌株中分布广泛。rPagC有良好的免疫原性及较强的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。     

分子信标PCR检测脲原体U.Parvum和U.Urealyticum

目的 建立2个快速、同步检测脲原体U．Parvum和U．Urealyticum的分子信标PCR反应体系。方法 依据脲原体尿素酶B基因序列，设计分别针对U．Parvum和U．Urealyticum的特异性分子信标探针及引物，建立2个分子信标PCR反应体系。通过对脲原体标准株扩增后荧光强度的检测、分子信标S／B值测定以及进行特异性和敏感性实验，对2个体系进行评价并设定2个分子信标PCR反应体系的cutoff值。结果 U．Parvum和U．Urealyticum的分子信标S／B值均〉20。2个分子信标PCR体系能够检测U．Parvum、U．Urcalyticum标准株DNA．与其他14株细菌（包括5株有尿素酶细菌）无交叉反应，检测限度均为10拷贝／μl的重组质粒DNA。U．Parvum分子信标PCR反应体系的cutoff值为3．89．U．Urealyticum分子信标PCR反应体系的cutoff为5．32。结论 2个分子信标PCR反应体系能够快速、同步进行脲原体的分种鉴别，具有高度特异性和灵敏性。     

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157：H7的rfbE保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，用FAM荧光剂标记探针的5’端，建立改良分子信标实时PCR检测O157：H7的反应体系，应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌。只有大肠杆菌O157：H7有荧光信号，其余10种全无荧光信号，且与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为64fg，菌液灵敏度为59cfu／ml或2cfu／PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157：H7均出现特异的荧光信号，无干扰。对89份食品样品进行检测，5份O157：H7实时PCR阳性，其余样品为阴性，检测仅需2h。5份阳性样本，经传统方法培养，有3份检出大肠杆菌O157：H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

运用于embB 285 codon点突变的分子探针设计及检测研究

目的探讨单碱基靶点分子探针设计模型，并应用设计的分子信标探针检测结核杆菌耐乙胺丁醇embB 285 codon点突变，并与测序结果比较以验证。方法运用软件Beacon designer设计embB基因包含285codon的分子信标，应用荧光分光光度计检测embB 285 codon扩增片段与探针杂交后荧光信号，同时对扩增产物测序并作比较。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及耐乙胺丁醇embB 285 codon PCR产物与分子信标杂交后荧光信号差异存在统计学意义；33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较，耐乙胺丁醇组embB 285 codon突变检出率为15％，测序法突变检出率为15％。结论分子信标技术对单碱基靶点突变具有较高的检出率；应用荧光分光光度计直接检测液相杂交荧光具灵敏、简单、准确等优点。     

用PCR扩增16SrRNA基因鉴定甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株

目的: 探讨甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的检测与鉴定方法.方法:提取甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,根据甲型副伤寒沙门菌的16SrRNA基因保守序列设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳与分析.结果:甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的PCR扩增产物16SrDNA,在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带和图谱.结论:甲型副伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学方法可检测的绝大多数表型特征,但采用聚合酶链反应方法检测该序列,有利于检测和鉴定不能自发返祖的细胞壁缺陷甲型副伤寒沙门菌.     

The Widal test in a normal healthy population in the Sudan

The Widal test was performed in 114 normal individuals from the Gezira area in Sudan. Salmonella typhi O agglutinins were found at a titre of 1.320 in 12 (10.5%) of them. Salmonella paratyphi A agglutinins were found at 1.160 in 5 (4.3%) and Salmonella paratyphi B "O" agglutinins were found in 6 (5.3%) at a titre of 1.160. None of these individuals had a history of typhoid fever or vaccination with TAB vaccine. The following points emerged: (i) normal healthy people in the Sudan have high antibody titres of Salmonella typhi; (ii) the Widal test in the Sudan should be interpreted against this background; (iii) previous diagnostic titre of 1.160 for S. typhi results in high false positive results; (iv) a titre above 1.320 is suggested as diagnostic for S. typhi; 1.160 for both S. partyphi B and S. paratyphi A.     

丙型副伤寒沙门氏菌噬菌体SPC-P1在不同血清型中的分布及整合位点分析

目的:确定丙型副伤寒沙门氏菌( Salmonella paratyphi C, SPC)噬菌体SPC-P1在其他血清型中是否存在,并确定其在宿主菌基因组中的整合位点. 方法:以丙型副伤寒沙门氏菌RKS4594基因组中SPC-P1为模板,设计6对引物,分别在11株伤寒沙门氏菌、11株甲型副伤寒沙门氏菌、12株乙型副伤寒沙门氏菌和23株丙型副伤寒沙门氏菌中进行SPC-P1片段的扩增. 同时下载美国国立生物技术信息中心( National Center for Biotechnology Informa-tion,NCBI)基因组数据库中全基因组序列完成的100株20个血清型的沙门氏菌全基因组序列,通过Mauve 2. 3. 1软件进行比对,以确定SPC-P1在各个血清型中的分布. 根据SPC-P1在RKS4594基因组中的整合位点,设计引物,对10株SPC-P1阳性的丙型副伤寒沙门氏菌进行扩增,并对产物测序,根据测序结果分析SPC-P1 整合情况. 结果:SPC-P1广泛存在于丙型副伤寒沙门氏菌基因组中,14株能够扩增到所有的6个片段,2株扩增到3~5个片段,所有扩增阳性的片段与预期大小吻合. 在伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌中,6个片段均阴性或仅存在1~2个片段,并且片段均比预期小. Mauve比对结果显示,仅在与丙型副伤寒沙门氏菌进化关系较近的猪霍乱沙门氏菌中存在接近完整SPC-P1的片段,但序列相似性存在差异. SPC-P1在丙型副伤寒沙门氏菌基因组中的整合位点是固定的,位于两个相邻基因 pgtE 和yfdC之间. 结论:SPC-P1是丙型副伤寒沙门氏菌独特的致病因子,其存在可能使得丙型副伤寒沙门氏菌的宿主范围、致病性大小等功能方面有别于其他沙门氏菌.     

2005-2009年贵州省伤寒和副伤寒沙门菌耐药性分析

目的分析贵州省伤寒和甲型副伤寒沙门菌的耐药状况,为临床用药及防控提供依据。方法采用改良K-B法对伤寒、甲型副伤寒沙门菌株进行药物敏感试验。结果贵州省9个市(州、地)26个县(区)的113株伤寒沙门菌和518株甲型副伤寒沙门菌对10种抗生素进行药物敏感性测定。其中伤寒沙门菌除对C IP不耐药,对其余9种抗生素均有不同程度的耐药,甲副沙门菌仅对CFT、NAL、SMZ有不同程度耐药,耐药率达0.88%~95.95%,个别地区出现了对第三代头孢类药的多重耐药株。结论贵州省伤寒、甲副沙门菌耐药情况已较为严重,尤其是多重耐药菌可能会造成伤寒和甲型副伤寒的流行或暴发。加强耐药性监测,指导临床合理用药,对预防控制伤寒和甲型副伤寒具有重要意义。     

巢式聚合酶链反应扩增外周血吞噬细胞内外伤寒沙门菌Vi基因

目的：明确外周血吞噬细胞内外伤寒沙门菌Ｖｉ基因检测在伤寒诊断中的意义。方法：高速离心沉淀,低渗溶解红细胞法分离８５例临床拟诊伤寒患者外周血吞噬细胞（内）及吞噬细胞外（血清中）伤寒沙门菌,巢式聚合酶链反应扩增伤寒沙门菌Ｖｉ基因;并与单管套式聚合酶链反应扩增粒细胞内伤寒沙门菌Ｈ基因、巢式聚合酶链反应扩增单核细胞内伤寒沙门菌Ｖｉ基因、１次聚合酶链反应扩增血清中伤寒沙门菌Ｈ基因比较。结果：巢式聚合酶链反应     

Evaluation of antibiotic sensitivity pattern in cases of enteric fever in north west Rajasthan

A total of 50 cases of blood culture proved enteric fever were studied for clinical response to the treatment and compared with in vivo antibiotic sensitivity pattern. Out of 50 Salmonella strains isolated, 37 were S typhi and 13 S paratyphi A. All S typhi isolates were sensitive in vitro to gentamicin and ceftriaxone while sensitivity to ciprofloxacin was 73%, ampicillin 29.7%, chloromphenicol 27%, tetracycline 27% and co-trimoxazole 13.5%. Multidrug resistance (Ampicillin, Chloramphenicol, Cotrimoxazale and Tetracycline) was observed in 62% isolates. All Sparatyphi A isolates were sensitive to all the antibiotics. Clinical response to the antibiotic therapy was as follows: Group I--Ampicillin + Gentamicin: 15 cases, clinical response (CR), 9.1% (S typhi) and 75% (S paratyphi A), mean day of defervescence 5.33 days. Group II--Ciprofloxacin: 29 cases, clinical response 47.6% (S typhi) and 75% (S paratyphi A), mean day of defervescence--5.22 days. Group--III Ceftriaxone: 30 cases, clinical response 100% in all, mean day of defervescence--4.93 days. Thus we observed highly significant discrepancy in antibiotic sensitivity pattern of the isolates and clinical response. Most importantly we observed significantly delayed clinical response to the ceftriaxone. This may be indicative of evolving resistance to ceftriaxone.     

伤寒沙门菌多重耐药acrAB全基因的检测及序列分析

目的：伤寒沙门菌275主动外排系统acrAB全基因测序并分析其结构。方法：以伤寒沙门菌基因序列为参考设计引物,以PCR法对伤寒沙门菌275 acrAB全序列进行调取并测序。 结果：伤寒沙门菌275 acrAB全序列与参考伤寒沙门菌(No.AL627267)同源性99．38％,与大肠本杆菌(No．U00734)同源性84．69t%。伤寒沙门菌275 acrR正向编码217个氨基酸．acrA反向编码397个氨基酸,acrB反向编码1049个氨基酸,同参考伤寒沙门菌比较,acrR相同.acrA、acrB各一处小同;与大肠杆菌比较．同源性分别为86．98%、91.69％、94.66%。acrA、acrR启动区位于4367～4507碱基处,SD序列(RBS)位于4373～4377碱基处。acrA与acrB间隔区位于3151～3172碱基处,SD序列(RBS)化于3161～3165碱基处。结论：伤寒沙门菌acrAB主功外排系统在结构、碱基序列和编码的氨基酸序列上均与大肠杆菌有很高的同源性,它可能是伤寒沙门菌引起多重耐药的主要原因。