嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。     

空气中嗜肺军团菌的巢式PCR和荧光定量PCR测定方法比较

目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量PCR法检测样品中的嗜肺军团菌。结果共采集气溶胶样品165份。巢式PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为8.5%(14/165),荧光定量PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为26.1%(43/165),后者高于前者,差异有统计学意义(P0.05)。结论采用荧光定量PCR法测定空气中嗜肺军团菌的灵敏度优于巢式PCR法。     

军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。     

快速检测空调冷却水中Lp1型嗜肺军团菌实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立嗜肺军团菌Lp1型实时荧光定量PCR检测方法,以实现对中央空调冷却水中嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。方法基于Lp1型嗜肺军团菌基因组ORF11区域设计特异性的引物和探针,建立体系,验证方法的灵敏度、特异性和重复性,并对模拟的中央空调冷却水水样进行检测。结果该方法的检测灵敏度达3.8×10 cfu/ml,具有良好的特异性,仅嗜肺军团菌Lp1型菌株呈阳性结果,重复检测平均Ct值变异系数。对模拟的水样进行检测,与方法的灵敏度相一致,且具有良好的重复性。结论该方法可实现对嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。     

中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与荧光PCR结果比较

目的中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与TaqMan荧光定量PCR检测结果比较。方法对9家商场、宾馆、医院、办公楼公共场所中央空调系统的冷却塔水、生物膜、淤泥三环节样本进行军团菌检测,用传统细菌分离培养法分离鉴定,并用TaqMan荧光定量PCR法加以验证。结果本次对9家单位的水冷式中央空调系统三环节采样18份,其中传统细菌培养法检出4份军团菌,检出率为22.2%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为22.2%、25.0%、20.0%。用荧光PCR法检出9份,检出率为50.0%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为44.4%、50.0%、60.0%。结论金华市中央空调系统中存在嗜肺军团菌,荧光PCR检出率高于传统细菌培养法。     

应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌

目的　建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。　方法　采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。　结果　该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。　结论　该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法     

公共场所相关土壤样品中嗜肺军团菌的调查

目的采用巢式PCR和荧光定量PCR方法检测公共场所相关土壤样品中嗜肺军团菌的污染状况。方法于2012年8—10月,在我国南北方2个城市共选取3种类型的公共场所16家,采集空调风管积尘、场所内花卉土和场所周边景观土;同时选取3个居民区,采集小区内的浅层地面土作为环境背景土;分别应用巢式PCR和荧光定量PCR方法检测样品中的嗜肺军团菌。结果公共场所空调积尘、场所内花卉土和周边景观土嗜肺军团菌巢式PCR的阳性检出率分别为45.8%(11/24),34.5%(10/29)和44.4%(4/9),荧光定量PCR测定嗜肺军团菌的浓度水平为1.1×103~8.1×105 copies/g。结论通过本次调查,公共场所空调积尘、场所内花卉土和周边景观土存在嗜肺军团菌污染。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

传统细菌培养法与荧光PCR法分离公共场所嗜肺军团菌结果比较

目的：对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行嗜肺军团菌监测,掌握南京市公共场所中军团菌的污染情况和菌型分布。方法：对12家商场、医院中央空调系统采集水样（冷却水、景观水、淋浴水、自来水）,土壤类样品（背景土、花卉土、风管积尘、景观土）,采用传统细菌培养法及荧光PCR法进行嗜肺军团菌的分离鉴定。结果：12家单位共采样234份（水样88份、土壤146份）,传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1型）,检出率为3.85%;而实时荧光PCR法检出47份阳性（主要类型为Lp1型）,检出率为20.08%。两者检出阳性率比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：南京市公共场所存在嗜肺军团菌污染,荧光PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法,荧光PCR方法较培养法灵敏性较好。     

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景。方法:40株分离株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5S rRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析。结果:所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异。结论:所有菌株经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株存在遗传多样性。     

酒店浴室花洒头上检出嗜肺军团菌的报告

目的 了解上海市奉贤区部分公共场所环境中军团菌的污染状况,为军团菌病的预防控制提供依据.方法 采集该区使用集中式空调系统的大型酒店及超市的环境样品共80份进行军团菌检测,将聚合酶链反应(PCR)技术和常规方法结合,样品先进行PCR检测,阳性样品再进行常规分离和鉴定.结果 从某酒店的浴室花洒环节标本中检出2株嗜肺军团菌.结论 环境中有嗜肺军团菌存在,易受到感染,存在隐患.     

Real-Time荧光PCR结合微量凝集试验早期诊断军团菌感染

[目的]建立基于微量凝集试验和Real-Time荧光PCR两种方法上的军团菌早期诊断方法。[方法]对收集的疑似军团菌感染的血清标本配对同时进行微量凝集试验和Real-Time荧光PCR,比较两种方法的检测结果,并对结果加以解释。[结果]两种方法采用同样的标本但反映的信息各有不同,两种方法的结果有66.7%的符合率,两种方法的差异无统计学意义。[结论]微量凝集试验和Real-Time荧光PCR两种方法结合对临床军团菌病进行早期诊断具有标本易于获得,实验操作简单、快捷的优点。     

烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立

目的 建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法.方法设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法.结果构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100％检出,对常见杆菌检测均为阴性.结论多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值.     

三种分子分型技术在嗜肺军团菌分型中的应用与评价

目的对脉冲场凝胶电泳方法 （PFGE）、基因序列分型（SBT）和mip基因分型方法在嗜肺军团菌分型研究中的分辨力和潜在价值进行比较和论述。方法采用PFGE、SBT和mip基因分型方法对29株嗜肺军团菌和1株标准菌株ATCC33153进行分型比较。结果 PFGE可将30株嗜肺军团菌分为5大类群,19个PFGE型,分辨力为0.9586;SBT可分为22个ST型,分辨力为0.9609;mip基因分型可分为9个型别,分辨力为0.8344。血清型LP1和LP14菌株具有相同的PFGE和mip基因型别,相同或相近的SBT型别。结论 SBT较PFGE具有稍高的分辨力,适用于全球数据库比对和进化亲缘关系的研究,结合PFGE和SBT分型方法有利于流行病学溯源分析。     

荧光定量PCR仪技术及其在医学中的应用

荧光定量PCR仪技术是一种新的核酸定量技术，该技术在PCR仪反应系统中引入了荧光标记探针，具有可实时监测、高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，极大地克服了原有PCR仪技术的不足，扩大了PCR仪的应用范围。     

公共场所人群嗜肺军团菌血清抗体水平的调查研究

目的:了解温州市部分人群血清嗜肺军团菌的抗体阳性率以及嗜肺军团菌抗体(LP1～10)的分布特点。方法:采用微量凝集试验(MAT)测定就业人员血清中嗜肺军团菌1至10型抗体滴度。结果:1000例人群血清抗嗜肺军团菌抗体阳性89例,总阳性率为8.9%,其中暴露人群血清中嗜肺军团菌感染的阳性率11.6%(58/500),对照人群血清中嗜肺军团菌感染的阳性率6.2%(31/500),阳性率有显著性差异,暴露人群高于对照人群(χ2=8.991,P<0.05)。在阳性结果中,2种及以上血清型同时阳性为17份,占19.10%(17/89)。结论:我市健康人群普遍存在不同程度和不同血清型的嗜肺军团菌隐性感染,使用中央空调的场所是嗜肺军团菌感染的高危场所,应加强监测。     

环境水中嗜肺军团菌的分离培养法和巢式PCR法比较

目的应用传统分离培养法和巢式PCR法检测环境水中嗜肺军团菌污染状况,并比较两种方法的检测效果。方法于2012年7-10月,采集北京市丰台区商场和超市、宾馆和饭店、综合性医院三类场所的中央空调冷却水、自来水、淋浴水、景观水,分别使用培养法及巢式PCR法检测嗜肺军团菌。结果共检测187件水样,传统分离培养法对嗜肺军团菌的检出率为2.67%(5/187),低于巢式PCR法[19.79%(37/187)],差异有统计学意义(χ~2=27.465,P0.01)。结论北京丰台区多种环境水体存在嗜肺军团菌污染;巢式PCR法对环境水中嗜肺军团菌的灵敏度优于传统分离培养法。