多价抗人精浆蛋白/抗人CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的　构建多价抗人精浆蛋白 (γ Sm) /抗人CD3 双特异性单链抗体 (scFv)基因 ,并进行真核表达和活性测定。　方法　利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3/p5 3克隆载体。将抗人CD3 scFv(CD3 scFv)和抗人γ SmscFv(γ SmscFv)依次克隆入pUC1 9/IgG3/p5 3载体中 ,构建多价双特异性γ SmscFv/CD3 scFv[scFv2 (CD3 /γ Sm) ]融合基因。将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后流式细胞仪进行活性测定。　结果　获得了多价scFv2 (CD3 /γ Sm)融合基因 ,基因全长 1 6 38bp ,可编码 5 4 6个氨基酸 ,与已发表的γ SmscFv、CD3 scFv和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 6 70 0 0的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞和人外周血单个核细胞 (PBMC) ,亲和力高于双特异性scFv。　结论　获得了可与PBMC和PC 3细胞特异结合的多价scFv2 (CD3 /γ Sm) ,为进一步临床应用提供了实验依据     

抗人γ-精浆蛋白单链抗体四聚体的构建及表达

目的　构建抗γ 精浆蛋白 (γ Sm )单链抗体 (scFv) /p5 3四聚功能域 ( p5 3TD)融合基因 ,并进行真核表达和活性测定。方法　利用递归聚合酶链反应 (PCR)法扩增IgG3上游铰链区与p5 3TD融合基因 ,克隆入 pUC19载体中构建 pUC19/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗γ SmscFv克隆入该载体中 ,构建抗γ SmscFv/p5 3TD融合基因并克隆入真核表达载体 pSecTag2 B ,转染HeLa细胞表达纯化后 ,利用流式细胞仪 (FCM )进行活性测定。结果　获得了抗γ SmscFv/p5 3TD融合基因 ,基因全长 891bp ,可编码 2 97个氨基酸。表达产物经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western印迹实验证实为约 3 5× 10 3 的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞 ,亲和力高于scFv。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的四价抗γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础。     

抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的活性研究

目的:研究并比较已成功构建的抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的生物学活性。方法:利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果。建立前列腺癌裸鼠模型,分为非治疗组、对照组、双特异性单链抗体(BsAb)组和多价双特异性单链抗体(mBsAb)组,分析两种双特异性单链抗体在体内介导细胞毒T细胞对肿瘤细胞杀伤的能力。结果:流式细胞仪结果显示:BsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为56.3%和55.4%;mBsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为74.0%和83.0%。在体外,有细胞毒T细胞存在时两种抗体均可引起前列腺癌细胞的裂解,裂解效率分别与抗体浓度和T细胞与靶细胞比例呈正相关。与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P<0.05)。在亲和力、体外杀伤和体内抑制肿瘤生长等方面,mBsAb的活性明显优于BsAb。结论:抗PSA/抗人CD3 BsAb及其四聚体均具有良好的生物学活性,单链抗体四聚体的形成可以明显改善抗体的生物学活性。     

抗前列腺特异抗原/抗人CD3双特异性单链抗体基因在HeLa细胞中的表达及亲和活性测定

目的　在HeLa细胞中表达抗前列腺特异抗原 (PSA ) /抗人CD3双特异性单链抗体(scFv)融合基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗PSA/CD3双特异性scFv融合基因基础上 ,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　经SDS PAGE和Western印迹实验证实 ,表达产物的Mr约为 65 0 0 0。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合PC 3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC)。结论　获得了可与PC 3细胞和PBMC特异结合的抗PSA/CD3双特异性scFv ,为进一步临床应用奠定了基础。     

抗前列腺特异抗原航CD3双特异性单链抗体四聚体的制备

本实验旨在构建人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因和抗前列腺特异抗原／抗CD3双特异性单链抗体的基础之上，进一步制备该双特异性单链抗体的四聚体。     

抗人精浆蛋白单链抗体的构建及表达

目的构建抗人精浆蛋白单链抗体（γＳｍＳｃＦｖ）,为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体γＳｍＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ分离获得了γＳｍＭｃＡｂ轻、重链可变区（ＶＬ、ＶＨ）基因,用连接肽将其构建成具有ＶＨＬｉｎｋｅｒＶＬ结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ４Ｔ１中进行表达。结果经测序表明,ＶＨ、ＶＬ及Ｌｉｎｋｅｒ的序列均正确。ＳｃＦｖ在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的４０％。结论构建的抗人精浆蛋白单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础     

人源性抗前列腺特异性膜抗原单链抗体的基因构建、表达及鉴定

目的:分别构建人源性抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单链抗体(sc Fv)/鱼精蛋白截短体(tp)、sc Fv/弗林蛋白酶识别位点(Fdt)/流感病毒融合肽结构域(HA2)/tp融合蛋白基因。利用原核表达体系表达、纯化并检测sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp,将获得的基因克隆入原核表达载体p ET28,在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western印迹鉴定,通过Ni2+-NTA螯合层析纯化。ELISA分析融合蛋白抗原亲和活性。结果:成功构建了人源性抗PSMA融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白均能与PSMA抗原结合。结论:融合蛋白具有结合抗原的活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。     

抗TAG-72抗原单链抗体的原核表达及对人肝癌的检测

目的探讨抗肿瘤相关糖蛋白-72（TAG-72）单链抗体的原核表达及与4种肝癌细胞系和肝癌组织的特异性亲和力。方法将抗TAG-72单链抗体的cDNA片段插入噬菌粒载体pCANTAB5E,获得噬菌粒载体TAG-72-scFv-pCANTAB5E。将后者转化入E.coliHB2151,经β,D异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得抗TAG-72单链抗体蛋白。采用细胞培养及免疫细胞/组织化学方法 ,检测4种肝癌细胞系及石蜡包埋的肝癌组织中TAG-72抗原的表达。结果 SDS-PAGE及Western blot法证实,抗TAG-72单链抗体蛋白分子得以正确表达。抗TAG-72单链抗体可与肝癌细胞系SMMC7721、HepG2和HHCC结合,表明这3种细胞表达了特异性肿瘤抗原;抗TAG-72单链抗体不能结合BEL7402细胞。40例肝癌组织中TAG-72抗原表达阳性率Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期分别为23.08%（3/13）和62.96%（17/27）,在正常肝组织标本中无TAG-72抗原表达,TAG-72抗原在正常肝组织及肝癌组织中表达的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 TAG-72抗原在肝癌细胞或肝癌组织中有特异性表达,有可能成为判断肝癌的标志物。     

抗人膀胱癌单链抗体的构建及表达的研究

目的 为膀胱癌的导向诊断和治疗提供免疫原性更低的单链抗体。方法 从1株分泌鼠抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株BDI-1中分离出总RNA。     

抗人AFP单链抗体的制备、鉴定及其免疫学活性的测定

目的 构建具有免疫学活性的抗人甲胎蛋白单链抗体ScFv (single chain fragment of variety region,ScFv),为进一步的研究奠定实验基础.方法 采用RT-PCR 技术,从分泌抗人AFP 单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb 的VH、VL 基因,并进一步将其组装成VH-Linker-...     

人源化抗p185单链抗体/人白细胞介素-2双功能融合蛋白在293细胞中的高效表达

目的　在 2 93细胞中表达人源化单链抗体 /人白细胞介素 2 (hIL 2 )双功能融合蛋白及评价其生物学活性。方法　将构建的表达载体转染 2 93细胞 ,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系 ,免疫印迹法 (Westernblot)、酶联免疫吸附试验 (ELISA )及 [3 H]脱氧胸苷 (3 H TdR)渗入法检测细胞上清中融合蛋白浓度和生物学活性。结果　融合蛋白浓度达 (10 2 .0± 4.2 ) g/L ,5 μl细胞上清即可在 45× 10 3 处呈现清晰蛋白条带。其中hIL 2无活性丢失 ,与标准对照比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;抗体的抗原结合活性有部分下降 ,与标准对照比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　该融合蛋白可在 2 93细胞系中得到高效表达 ,其中hIL 2部分无活性丢失 ,抗体的活性有部分下降     

抗精浆免疫抑制物抗体的抗生育机理研究

作者进行了抗精浆免疫抑制物抗体（ＳＰＩＭ－Ａｂ）的补体结合功能测定（ＣＦＡ）和ＳＰＩＭ－Ａｂ对精子凝集、制动、穿透力和杀精子影响的研究。结果表明，ＳＰＩＭ－Ａｂ阳性不育病人（ｎ＝２９）ＣＦＡ值为６．４７±１．５５ｋＵ／Ｌ，明显低于ＳＰＩＭ－Ａｂ阴性病人（ｎ＝７ｌ，８．１１±１．６２ｋＵ／Ｌ）和对照组（ｎ＝３０，８．６０±１．８０ｋＵ／Ｌ），Ｐ＜０．０１。经ＳＰＩＭ－Ａｂ阳性血清和ＳＰＩＭ－Ａｂ阴性血清作用后，两组精子凝集、制动和死精子百分率分别为４１．４％和２１．１％、６９．０％和１６．９％、６２．１％和４．２％，精子穿透高度分别为３１．６±１３．０ｍｍ和３８．Ｏ±１２．９ｍｍ，经统计学处理差异显著（Ｐ＜０．０５～ｐ＜０．０１）。提示ＳＰＩＭ－Ａｂ能够以抗原抗体复合物形式激活补体，其对精子凝集、制动、杀伤和穿透力的影响，可能是干扰生育的重要原因之一。     

抗人膀胱癌基因工程单链抗体的制备研究

应用ＰＣＲ方法，从分泌鼠抗人膀胱癌抗体的杂交瘤细胞中扩增抗体重、轻链可变区基因，经ＤＮＡ接头连接后与噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５重组，转化大肠杆菌后，通过亲和筛选、再转染、克隆及鉴定，以此获得抗人膀胱癌噬菌体单链抗体。     

干扰素γ诱导蛋白10基因修饰小鼠树突状细胞的抗前列腺癌作用研究

目的　探讨转染干扰素γ诱导蛋白 10 (IP 10 )基因构建的加载树突状细胞 (DC)瘤苗 ,对特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的诱导作用。　方法　将RM 1细胞的裂解产物作为肿瘤抗原加载小鼠骨髓来源的DC(Tuly DC) ,将IP 10DNA插入真核表达质粒 ,通过脂质体法将IP 10基因转染至Tuly DC ,构建DC瘤苗 ;RT PCR法检测IP 10基因转染成功 ,趋化实验检测对淋巴细胞的趋化作用 ,混合淋巴细胞反应 (MLR)检测瘤苗刺激T细胞的增殖能力 ,MTT法检测瘤苗诱导的特异性CTL的杀伤活性。　结果　转染DC的IP 10表达明显增强 ,其上清对淋巴细胞有较强的趋化作用 ;DC瘤苗刺激T细胞增殖能力增强 ,每分钟闪烁计数值分别为 18913.0 9± 2 735 .33(1∶10 )和 17736 .6 7± 2 5 31.70 (1∶2 0 ) ,与各对照组相比差异有显著性意义 (P <0 .0 1) ;DC瘤苗诱导的CTL对RM 1细胞的特异性杀伤率分别为 (37.95± 5 .2 6 ) % (效靶比 2 0∶1)和 (43.87± 7.6 3) % (效靶比 4 0∶1) ,均高于各对照组 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 1)。　结论　所构建的前列腺癌DC瘤苗能有效提高其抗原提呈功能和特异性CTL的诱导。     

抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的制备

本实验旨在构建人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因和抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体的基础之上[1],进一步制备该双特异性单链抗体的四聚体.     

双特异性单链抗体介导的CIK细胞对结肠癌的体内杀伤作用

目的 观察双特异性单链抗体介导的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞在体内杀伤结肠癌细胞的作用.方法 将SW1116细胞种植裸鼠后,建立裸鼠结肠癌模型,分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞+双特异性抗体,每周治疗1次,共4周,取出肿瘤组织称重,并计算出各组的抑瘤率.结果 在体内,CIK组和CIK+双抗组均可抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为29.70%和65.02%,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).CIK组和CIK+双抗组的瘤体积、瘤重、抑瘤率比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长,在加入抗CD3抗癌胚抗原(CEA)双特异性单链抗体后抑瘤作用明显增强.

Abstract：

Objective To investigate the killing effect of cytokine-induced killer cell (CIK) mediated by bispecific single-chain antibody in vivo on colon cancer cells. Methods The colon cancer model in nude mice was established with SW1116 cells. The mice were divided into 3 groups, which were injected with normal saline, CIK cells and CIK cells + bispecific antibody, respectively, once a week for 4 weeks. The tumors were removed and weighed, and the tumore inhibition rate in each group was calculated. Results The CIK cells and CIK cells with bispecific single-chain antibody could both inhibit tumor growth in vivowith the tumor inhibition rate being 29. 70% and 65.02% respectively ( P ＜ 0. 05 ). There was significant difference in tumor inhibition rate between CIK cells and CIK cells with bispecific single-chain antibody ( P ＜ 0. 05 ). Conclusion CIK cells alone can inhibit tumor cell growth, CIK cells in combination with bispecific single-chain antibody can exert more significant antitumor effect.     

抗人膀胱癌/抗血管内皮生长因子双功能基因抗体对膀胱癌的生长抑制作用

目的　对抗人膀胱癌 /抗血管内皮生长因子 (VEGF)双功能基因抗体进行免疫定位研究并观察其对人膀胱癌生长的抑制作用。　方法　采用免疫组化和免疫电镜前染色法对 6 0例膀胱癌患者的手术切除标本进行免疫定位研究 ;构建人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型并注射双功能抗体 ,观察肿瘤生长情况 ,同时检测肿瘤微血管密度 (MVD)值及肿瘤细胞凋亡指数 (AI)。　结果　 6 0例膀胱癌标本 ,抗原检测阳性 5 3例 ( 88.3% ) ;对照组 2 0例 ,抗原检测阳性 1例 ( 5 .0 % )。治疗后第 2周 ,实验组小鼠皮下种植肿瘤大小 ( 2 1.4 7± 6 .5 7)mm2 ,对照组 ( 5 9.85± 15 .4 3)mm2 ;实验组MVD 2 14 8± 10 9,对照组为 4 0 5 6± 36 7;实验组肿瘤细胞AI为 17.2 6 ,对照组为 7.0 9。组间比较 ,差异均有显著性意义。　结论　抗人膀胱癌 /抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌有较好的靶向性 ,能够通过抑制肿瘤微血管形成和加速肿瘤细胞凋亡而抑制实验性人膀胱癌的生长     

人精浆抗精子抗体与顶体酶活性关系的探讨

目的 :研究精浆抗精子抗体 (AsAb)对精子顶体酶活力的影响。　方法 :用间接血凝法测定 34 32例不育男性和 6 5例生育男性精浆的AsAb ,并对其中的 2 882例不育男性精子用比色法进行了顶体酶活性的测定。　结果 :34 32例不育者精浆AsAb阳性率为 10 .2 0 %,2 882例进行了顶体酶活性测定的不育者精浆AsAb阳性率为 9.37%,对照组精子顶体酶活性明显高于各不育组 (P <0 .0 0 1)。不育组AsAb阳性组与AsAb阴性组比较顶体酶活性没有明显差异 (P >0 .0 5 ) ,顶体酶活性正常与异常组AsAb阳性率比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。　结论 :精浆AsAb对精子顶体酶活性没有影响。     

抗HER-2加抗CD3双特异抗体抑制胃癌细胞生长的实验研究

目的探讨基因工程抗HER-2 抗CD3双特异抗体(bispecific antibody,BsAb)对表达人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)的人胃癌细胞体外及体内生长的影响。方法用MTT方法测定Herceptin、抗CD3和BsAb抗体对胃癌细胞系SGC-7901的抑制率;免疫细胞化学法检测SGC-7901细胞的HER-2表达水平;建立裸鼠模型,将HER-2 CD3 BsAb与效应细胞(正常人外周血淋巴细胞)联合应用,观测各组荷瘤动物的肿瘤生长状况。结果正常对照组、抗CD3单克隆抗体联合效应细胞、Herceptin联合效应细胞及HER2 CD3 BsAb联合效应细胞肿瘤细胞的生长抑制率分别为0、(24.3±1.2)%、(56.2±2.6)%、(91.3±4.1)%各组荷瘤裸鼠与对照组的肿瘤体积为(0.86±0.02) cm~3、(0.52±0.04)cm~3、(0.20±0.06)cm~3、(0.11±0.02)cm~3,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),其中HER-2 CD3 BsAb联合效应细胞的抑制作用更为显著,与抗CD3 McAb联合效应细胞、Herceptin联合效应细胞组相比差异也有统计学意义(P<0.05)。结论HER-2/neu是胃癌免疫治疗的有效靶点,基因工程抗HER-2 抗CD3 BsAb在体外及体内均具有有效的抗肿瘤活性。     

基因工程HER2/CD3双特异抗体抑制乳腺癌生长的实验研究

近年来人们对难治性乳腺癌发生、发展相关生物学因素的认识不断深入。其中癌基因HER2/neu在乳腺癌诊断和免疫治疗中的研究进展最为显著。我们在成功建立BT-474人乳腺癌模型的基础上,探讨了抗HER2×抗CD3双特异抗体(HER2×CD3BsAb)与正常人外周血淋巴细胞联合应用对过度表达HER2