青蒿素对小鼠淋巴管内皮细胞凋亡和淋巴管形成的作用

目的:探讨抗疟药青蒿素(ART)对小鼠淋巴管内皮细胞增殖、凋亡和淋巴管形成的作用。方法:腹腔注射不完全弗氏佐剂诱导小鼠淋巴管瘤形成,分离并培养小鼠淋巴管内皮细胞(LEC)。采用MTT法检测ART对LEC的生长抑制作用。倒置相差显微镜和Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态学变化。FITC-Annexin V/PI双染流式细胞仪检测LEC细胞凋亡率。基质胶实验检测LEC体外淋巴管形成。结果:5-40μmol/L的ART显著抑制LEC细胞增殖。细胞经不同浓度的ART处理后,LEC细胞出现明显的凋亡特征。FITC-Annexin V/PI双染显示,与对照组比较,ART提高了LEC细胞凋亡率,具有一定的剂量依赖性效应关系。基质胶实验显示ART抑制LEC体外自发性管状结构形成。结论:青蒿素可作为抗淋巴管生成的抑制剂,其作用与其诱导LEC细胞凋亡有关。     

转录因子GATA家族在人血管内皮细胞中的表达

【目的】了解转录因子GATA家族在人血管内皮细胞中表达的情况。【方法】体外培养人的脐静脉内皮细胞(HUVECs)、主动脉内皮细胞(HAECs)、肺动脉内皮细胞(HPAECs)及肠系膜动脉内皮细胞(HMAECs)4种血管内皮细胞,取1×106个上述细胞采用RT-PCR法检测转录因子GATA家族mRNA在人的上述四种血管内皮细胞中的表达情况并对结果进行定性分析。【结果】GATA-2mRNA及GATA-3mRNA在上述4种血管内皮细胞中均表达,GATA-2mRNA及GATA-3mRNA在大部分人血管内皮细胞中表达,仅HUVECs细胞中未能检测到GATA-4的表达,HMAECs未能检测到GATA-6的表达。而在HUVEC、HAEC、HPAECs及HMAECs4种血管内皮细胞均未检测到GATA-1mRNA及GATA-5mRNA的表达。【结论】转录因子GATA家族在人不同血管内皮细胞中的表达是不一致的,GATA-2及GATA-3在上述4种血管内皮细胞中均表达,它们可能参与血管内皮细胞的基因调控。     

不同活化表型的巨噬细胞对淋巴管内皮细胞增殖、迁移和管样结构形成的影响

目的:探讨不同活化表型的巨噬细胞对淋巴管内皮细胞(LEC)增殖、迁移和管样结构形成的影响。方法:分别以mrIFN-γ、mrIL-4处理小鼠RAW264.7细胞,建立经典活化的巨噬细胞(caMphi)和替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)模型。采用transwell系统,将活化的巨噬细胞和LEC共培养。通过绘制细胞生长曲线、细胞迁移实验和基质胶实验,分别观察它们对LEC增殖、迁移和管样结构形成的影响。结果:与aaMphi共培养的LEC增殖速度较快,迁移能力和管样结构形成能力均明显强于其它对照组。结论:aaMphi能够促进LEC增殖、迁移和管样结构形成。     

替代性活化的巨噬细胞促进淋巴管内皮细胞增殖的机制

目的:观察替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)对淋巴管内皮细胞(LEC)增殖的影响机制.方法: 以重组小鼠IL-4处理小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h,建立aaMphi模型.采用Transwell系统共培养aaMphi和小鼠LEC,台盼蓝拒染法绘制LEC生长曲线,3H-TdR掺入法观察LEC增殖状况,实时定量RT-PCR法分别检测共培养前后血管内皮生长因子(VEGF)-C,VEGF-D mRNA在aaMphi中的表达,以及VEGFR-3,Prox1 mRNA在LEC中的表达.结果: 与aaMphi共培养后,LEC生长速度加快,增殖指数(PI)高于其他对照组.与共培养前比较,aaMphi表达VEGF-C mRNA增加(P《0.01),但表达VEGF-D mRNA无统计学变化(P》0.05);LEC表达VEGFR-3和Prox1 mRNA均增加(P《0.01, P《0.05).结论: aaMphi能促进LEC增殖; aaMphi表达VEGF-C mRNA和LEC表达VEGFR-3, Prox1 mRNA增加是其作用机制之一.     

以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立

目的:建立一个简便、廉价和稳定的小鼠淋巴管内皮细胞(LEC)培养体系. 方法:应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,消化法分离获得LEC,置于自制的鼠尾胶包被的培养瓶(板)中培养. 以免疫荧光化学法检测LEC特异性标记物VEGFR-3和LYVE-1的表达,以3H-TdR掺入率测定和细胞倍增时间检测LEC的增殖活力,以淋巴管形成试验判定LEC能否形成淋巴管样结构. 结果:不完全弗氏佐剂能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,所获LEC活细胞数大于98%. 免疫荧光化学检测表明, LEC表达VEGFR-3和LYVE-1. 在鼠尾胶包被的培养瓶(板)中, LEC生长状况良好, 3H-TdR掺入率明显增加,倍增时间为(42.7±3.2) h;在鼠尾胶凝胶中,LEC能形成淋巴管样结构. 结论:鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.     

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的　研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法　①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果　①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论　内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　 (1)用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型 ;(2 )研究该体外模型耳蜗微血管内皮细胞的跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透曲线 ,并与脑及肺的内皮细胞通透性进行对照。结果　 (1) 3种内皮细胞的体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图均呈抛物线型上升曲线 ,其通透性从小到大依次为脑、耳蜗、肺内皮细胞 ,各组间相差显著 (P <0 .0 1) ;(2 )耳蜗、脑及肺 3种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态增加过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻均到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小分别为脑 (2 4 4 .7± 4 6 .9Ω/cm2 ) >耳蜗 (118.9± 18.5Ω/cm2 ) >肺 (4 6 .6± 5 .9Ω/cm2 ) ,且各组间相差显著 (P <0 .0 1)。结论　该模型下耳蜗微血管内皮细胞的通透性与其活体时的通透性特征基本一致。     

内皮细胞Rho/Rho激酶介导纤维肉瘤细胞血管外游走的机制

目的 研究内皮细胞Rho/Rho激酶在纤维肉瘤细胞血管外游走过程中的调控机制.方法 采用血管外游走体外模型观察纤维肉瘤细胞血管外游走状况;测定游走过程中血管内皮单细胞层电阻变化;进行细胞内磷酸化实验,利用放射自显影技术评价纤维肉瘤细胞游走过程中内皮细胞肌球蛋白轻链磷酸化水平.结果 纤维肉瘤细胞可以穿过血管内皮细胞游走至血管外.在游走过程中跨血管内皮细胞层电阻下降,内皮细胞肌球蛋白轻链磷酸化水平升高.内皮细胞Rho抑制剂(C3转移酶)、Rho激酶抑制剂(Y-27632)能够抑制上述变化.结论 内皮细胞Rho/Rho激酶可能是通过调节肌球蛋白轻链磷酸化水平诱导纤维肉瘤细胞向血管外游走.     

胃癌细胞环氧合酶-2的表达对内皮细胞生物学行为的影响

目的 以环氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)高表达的胃癌细胞系SGC7901及其反义核酸转染细胞为模型,观察胃癌细胞COX-2的改变对体外培养的内皮细胞迁移及其管状形成能力的影响,初步探讨COX-2的表达在胃癌血管发生过程中的作用.方法 通过半定量RT-PCR和Western bloc检测SGC7901、7901-P(空栽体对照)、7901-AS(反义COX-2转染细胞)细胞中COX-2的蛋白及mRNA表达水平.采用半定量RT-PCR技术检测3组细胞中内皮细胞特异性血管发生因子的表达;然后收集其条件培养基刺激内皮细胞,观察不同条件下内皮细胞迁移的数目及其所形成管腔样结构的长度.结果 反义核酸转染后.COX-2 mRNA及蛋白表达水平均较亲本细胞及其空载体转染细胞降低;胃癌细胞VEGF、Ang-1的表达明显下调,其条件培养基刺激内皮细胞后,内皮细胞的迁移能力及管状形成能力均较亲本细胞和空载体转染细胞下降(P<0.01).结论 抑制COX-2表达可降低内皮细胞的血管生成能力.COX-2的过度表达可能通过提高血管发生因子的水平来影响内皮细胞的迁移和血管形成,从而促进肿瘤的发生、发展及其转移.     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

子痫前期血清对血管内皮细胞凋亡及细胞因子表达的影响

目的 探讨子痫前期患者血清诱导血管内皮细胞核因子-κB(NF-κB)活性及血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的结果.方法 对血管内皮细胞株进行体外培养,分别加入正常妊娠及子痫前期患者血清.2 h后Western blot法测定细胞胞浆NF-κB抑制因子(I-κB)和胞核NF-κB活性;48 h后流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫法测定VCAM-1的表达.结果 子痫前期患者血清培养的血管内皮细胞胞浆I-κB含量明显低于正常妊娠血清培养组(P＜0.05),胞核NF-κB 含量以及VCAM-1的表达明显高于正常妊娠血清培养组(P＜0.05).结论 子痫前期患者血清可促进血管内皮细胞VCAM-1的表达、NF-κB的活性以及血管内皮细胞的凋亡;NF-κB在子痫前期患者血清促血管内皮细胞凋亡及VCAM-1的表达过程中可能起重要作用.     

TGFβ1对人血管内皮细胞整合素β3及粘着斑激酶表达的影响

目的　观察转化生长因子 β1 ( TGFβ1 )对培养的人血管内皮细胞表面整合素 β3 表达及粘着斑激酶 ( focal adhesion kinase,FAK)活性的影响。方法　采用细胞 - EL ISA和免疫沉淀 -蛋白质酪氨酸激酶活性测定法。结果　 1ng/ m l、5 ng/ ml及 10 ng/ ml浓度的 TGFβ1 分别作用于培养的人血管内皮细胞 ( ECV30 4) 6、2 4和 48小时后 ,其细胞表面整合素 β3 蛋白的表达均增加 ( P<0 .0 5 ) ,且呈剂量依赖性。 5 ng/ m l和 10 ng/ m l的 TGFβ1 作用于培养的 ECV30 46小时和 2 4小时后 ,细胞中 FAK活性明显增高 ( P<0 .0 5 )。结论　 TGFβ1 促进血管内皮细胞表面整合素 β3 的表达和 FAK活性增高 ,可能是单核细胞和内皮细胞之间粘附功能增加 ,血管增生的机制之一     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的　探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法 ,建立血管内皮细胞培养模型 ,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法　采用胶原酶Ⅱ灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞 ,当原代培养细胞 80 %以上汇合后 ,用胰蛋白酶消化传代 ;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术 (FM术 )免疫荧光检查对细胞进行鉴定。结果　种植在培养瓶中的内皮细胞 12小时贴壁生长 ,48～ 72小时生长最快 ,7～ 10天汇合。内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观 ,FM术检测CD3 1和VⅢ -R -Ag均为阳性表达。 结论　消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法 ,可靠性大 ,成功率高 ,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的 分离和培养人腹膜微血管内皮细胞.方法 取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养.组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞.结果 运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好.结论 实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源.     

同型半胱氨酸硫内酯诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及其分子机制的研究

目的:探讨同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone,HcyT)对人脐静脉内皮细胞凋亡及caspase3基因表达的影响及抗氧化剂干预后上述指标的改变。方法:一定浓度HcyT及抗氧化剂作用细胞后,碘化吡啶染色流式细胞仪、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot免疫印记法测定caspase3mRNA和蛋白表达。结果:HcyT以剂量依赖性方式诱导内皮细胞凋亡且caspase3mRNA及蛋白表达随其作用浓度的增加而升高(P<0.05)。1mmol/L HcyT浓度时,应用抗氧化剂干预,N-乙酰胱氨酸、维生素E及核转录因子抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸使凋亡细胞百分率从(23.16±4.27)%分别降至(1.95±0.23)%、(11.01±2.62)%、(11.46±1.81)%(P<0.05)。结论:HcyT诱导内皮细胞凋亡过程中,caspase3发挥重要作用。抗氧化剂可能通过抑制氧化损伤,下调caspase3表达,对内皮细胞凋亡发挥防治作用。     

VEGF诱导人骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性

目的:研究内皮细胞生长因子(VEGF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向内皮细胞定向分化的可行性并观察其生长增殖特性.方法:采用密度梯度离心法获取大量较纯的骨髓间充质干细胞,分为2组,实验组以含VEGF的M199培养液进行体外诱导分化,对照组用M199培养液培养.通过光镜、电镜及免疫组织化学染色方法分别观察所分化细胞的形态及表型,并绘制细胞生长曲线.结果:培养早期BMSCs多呈扁平、梭形、多角形形态,2周后实验组细胞渐呈集落状、椭圆形、铺路石样排列,而对照组细胞呈"毛发状"成纤维细胞外形.透射电镜下实验组细胞浆内有内皮细胞特征性单层质膜包裹结构--Weible-Palade 小体.对照组无此结构.实验组第3代细胞的Ⅷ因子相关抗原阳性比例接近(78.20±5.90)%,与人血管来源内皮细胞((82.70±4.47)%)相比,差异无统计学意义,而对照组细胞Ⅷ因子相关抗原染色呈阴性.生长曲线呈指数增长,短期内无明显衰老现象.结论:人BMSCs在VEGF的诱导下可定向分化为内皮细胞,并且保持了干细胞旺盛的增殖能力.     

内皮细胞对结肠癌细胞系SW480中CD133~+细胞表达VEGF的影响

目的 从结肠癌细胞系SW480中分离结肠癌干细胞,并检测内皮细胞对这些细胞表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 分别利用免疫磁珠分选技术和尤血清培养法富集CD133+细胞,利用MTT法和平板克隆形成实验检测其生物学特性;采用细胞免疫荧光法检测SW480细胞和CD133+细胞中CD133及VEGF的表达;将SW480细胞或磁珠分选CD133+细胞分别在6种培养条件下进行培养:SW480细胞在含血清培养基(serum-supplied medium,SSM)中培养、SW480细胞在尤血清培养基(serum-free medium,SFM)中培养、磁珠分选CD133+细胞在SFM中培养、SW480细胞与内皮细胞在SSM中共培养、SW480细胞与内皮细胞在SFM共培养、磁珠分选CD133+细胞与内皮细胞在SFM共培养,利用免疫组织化学法检测不同培养条件下结肠癌细胞中CD133及VEGF的表达情况.结果 SW480细胞系中存在少量的CD133+细胞,这些细胞能够连续传代并且表现出更强的增殖潜力以及克隆形成能力.经细胞免疫荧光法检测发现SW480细胞高表达VEGF,低表达CD133,而免疫磁珠分选的CD133+细胞所形成的细胞球低表达VEGF,高表达CD133.无血清培养条件下的SW480细胞随着时间的延长CD133表达率逐渐增加,添加内皮细胞诱导后无血清培养的SW480细胞与前者相比CD133阳性率显著增加(P<0.05).经过1周的连续培养后,CD133+细胞表达VEGF的比例没有变化,添加内皮细胞诱导1周后,CD133+细胞表达VEGF的比例显著增加(P相似文献   

动态种植法提高在去细胞猪瓣支架上种植内皮细胞效率和均匀性的研究

目的:尝试使用简单的动态种植方法来提高内皮细胞在去细胞牛心包支架上的种植效率和均匀性,以更有效地构建组织工程瓣膜.方法:采用胰酶-去垢剂法制备去细胞牛心包. 内皮细胞以下列方式在去细胞牛心包支架进行种植和培养: ①振荡种植振荡培养(OO);②振荡种植静止培养(OS);③静止种植静止培养(SS). 定期取样品进行电镜、组织学检测及细胞计数分析. 结果:细胞加入24 h后振荡种植的样品比静止种植的样品细胞在支架内分布更为均匀,同时振荡种植的样品细胞贴壁率[ (36±3) %]高于静止种植的样品细胞贴壁率[(21±2)%, P<0.05]. 振荡种植振荡培养的样品在培养过程中细胞脱离支架而死亡,因此放弃了这些样品的继续培养. 振荡种植静止培养的样品和静止种植静止培养的样品细胞一直保持正常的伸展状态. 在培养过程中支架上的活细胞总数振荡种植静止培养的样品一直高于静止种植静止培养的样品. 结论:采取振荡种植的方式种植细胞可明显提高内皮细胞在三维支架上种植的效率和分布均匀性.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人非小细胞肺癌血管内皮细胞体外分离培养体系,研究其体外生长特性。方法:利用酶消化法分离出肺癌组织微血管片段,采用植块培养法培养原代内皮细胞,先后以局部消化法和差速黏附法进行纯化;应用光镜、免疫细胞化学及免疫荧光技术对所获得的人肺癌血管内皮细胞进行鉴定。结果:所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞呈FⅧ-RAg、CD34阳性;电镜下生长状态良好、可传代培养。结论:本研究摸索并建立了人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养方法,所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞对肿瘤血管生成及抗肿瘤药物的研究具有重要价值。