EGFL7基因沉默对裸鼠乳腺癌血管生成的影响

Objective To investigate the effect of short hairpin RNA (shRNA) targeting at epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) gene on angiogenesis of breast carcinoma and its mechanism in nude mice. Methods shRNA targeting at EGFL7 gene was constructed and transfected into SGC-7901 cells (pshEGFL7 group) , meanwhile , the cells transfected with vector plasmids were as a control group. Positive clones were selected and the transplanted tumor animal models constructed in nude mice , and the growth and volume of tumors were observed. After 8 weeks , EGFL7 mRNA and protein in transplanted tumor tissues were detected,and graded. Moreover, Anti-CD34, VEGF and TSP1 were stained by the immuno- chemistry method,and MMP-2 and TIMP2 mRNA were detected by RT-PCR. Results EGFL7 mRNA was down regulated significantly in the pshEGFL7 group. In the psh EGFL7 group, the tumor volume was ( 1.86 ± 0. 65) cm3, MVD was 20. 84 ± 6.38; while in the control group , tumor volume was (4.86 ± 1.15) cm3, MVD was 39.48 ± 9.01, In the EGFL7 group ,TSP1 protein presented positive , and VEGF protein presented weakly positive or negative.The expression of MMP-2 mRNA decreased ,TIMP2 mRNA increased in the pshEGFL7 group,and there were significant differences compared with the control group , P ＜ 0.01. Conclusion RNA interference targeting at EGFL7 gene can balance TSP1/VEGF, through regulating the expression of MMP-2/TIMP2 to impair angiogenesis of breast cancer in nude mice.     

EGFL7在乳腺癌中的研究进展

表皮生长因子样结构域7是表皮生长因子样蛋白家族的成员,是一种极为关键的血管生成因子和血管发育调节因子,在不同类型细胞中均有表达。EGFL7在早期胚胎的血管中表达较高,主要调节发育过程中的血管生成,促进内皮细胞增殖,形成有功能的血管网,促进组织增长和再生。与其在胚胎期较强的表达相比,在成人体内的表达量微乎其微,异常高表达的EGFL7常在多种恶性肿瘤中出现。目前越来越多的证据表明,EGFL7可调节肿瘤血管生成、促进肿瘤转移和侵袭。肿瘤组织中EGFL7高表达常常提示肿瘤生长和转移较为活跃及不良的预后。近年来,一系列研究表明,EGFL7的表达与乳腺癌的发生发展、转移过程密不可分,且在提示预后方面发挥着关键作用。本文就EGFL7在乳腺癌中的研究进展作一综述,为临床诊断及治疗提供新思路。     

短发夹状RNA抑制GCS基因在人乳腺癌细胞的表达及逆转其多药耐药

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的短发夹状RNA(shRNA),观察其对人耐药乳腺癌细胞GCS表达的抑制及多药耐药的逆转作用。方法设计2对GCS基因编码的反向重复序列,中间间隔6个nt,体外合成并克隆至载体pSUPER。转染乳腺癌细胞,Westernblot和免疫细胞化学方法测定GCS表达。Westernblot、比色法检测细胞内caspase-3的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率。四氮唑盐(MTT)法检测半数细胞抑制浓度。结果酶切和DNA测序证实重组质粒构建成功。转染后GCS蛋白含量分别下降80%和82%,GCS表达阳性率降低为18·1%和16·7%。caspase-3表达和活性均显著增强,细胞凋亡率明显增加,细胞对化疗药物耐药性有明显下降。结论shRNA可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中GCS表达,并可提高其对多种化疗药物的敏感性。     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

迁移诱导蛋白7促进胃癌血管生成拟态

目的:体外观察胃癌细胞株形成血管生成拟态(VM)的能力,并通过Mig-7-siRNA转染SGC7901细胞,观察其对VM形成的影响,初步探讨其可能机制.方法:采用体外三维培养技术,在光镜及扫描电镜下观察不同分化程度的胃癌细胞形成VM的能力,并检测迁移诱导蛋白7(Mig-7)表达;通过Mig-7-siRNA转染SGC7901细胞,观察其对VM、侵袭及迁移能力的影响;Western blot检测SGC7901细胞中Mig-7、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1、2(p-ERK1/2)及基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达.结果:体外实验显示MKN45和SGC7901能形成VM,表达Mig-7;而MKN28和GES-1无形成VM能力,Mig-7表达阴性;Mig-7-siRNA转染SGC7901细胞后可干扰VM形成、侵袭及迁移能力;下调p-ERK1/2和MMP-2蛋白表达,可干扰VM形成.结论:能形成VM的细胞,可表达Mig-7;干扰Mig-7的表达,抑制VM的形成,可能与下调p-ERK1/2和MMP-2蛋白表达有关.     

siRNA特异沉默卵巢癌细胞CD59基因的裸鼠移植瘤研究

目的:通过体内动物实验研究CD59-siRNA对卵巢癌细胞CD59的沉默效应及抑瘤作用,探讨CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.方法:将转染CD59干扰质粒的A2780细胞(T组)、转染空质粒的A2780细胞(V组)及未转染的A2780细胞(C组)分别接种于裸鼠皮下,通过绘制肿瘤生长曲线,裸鼠移植瘤组织切片CD59 mRNA原位杂交及CD59蛋白的免疫组化研究其抑瘤效应及对CD59的沉默效应.结果:肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,CD59干扰质粒转染组肿瘤生长明显受抑制(P<0.05).原位杂交及免疫组化结果表明,干扰组的CD59 mRNA及CD59蛋白与对照组相比显著降低(P<0.05).结论:裸鼠体内实验表明,特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达,增加了卵巢癌细胞对补体攻击的敏感性,从而抑制卵巢癌在体内的生长,进一步说明了CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.     

应用表达载体介导siRNA抑制乳腺癌细胞MCF-7血管内皮生长因子-C基因的表达

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的抑制作用. 方法 设计合成一对编码后可形成小发夹结构针对VEGF-C基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建VEGF-CsiRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染MCF-7细胞,半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测转染前后MCF-7细胞VEGF-C基因表达的变化. 结果 PCR和DNA测序证实,携带VEGF-CsiRNA表达载体构建成功,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P<0.05),在mRNA水平其表达抑制率为61.8%;在蛋白表达水平其表达抑制率为78.3%. 结论 本研究构建的VEGF-CsiRNA表达载体可有效抑制MCF-7细胞VEGF-C的mRNA和蛋白表达,为进一步以VEGF-C为靶点的乳腺癌治疗实验研究奠定了基础.     

应用RNAi技术沉默STAT3基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的 探讨应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3（STAT3）基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响。方法 应用RNAi技术，以psilencer1．0-U6-STAT3-siRNA重组质粒体外转染MCF-7细胞，采用MIT实验、流式细胞仪检测MCF-7转染前后细胞增殖、细胞周期和早期凋亡的变化，通过Western blotting及半定量RT-PCR检测STAT3基因不同水平的表达。结果 MTT实验、流式细胞仪的结果显示，重组质粒转染组的MCF-7细胞的增殖明显受到抑制，且出现凋亡现象；Western blotting及半定量RT-PCR结果显示，重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在蛋白及RNA水平上都显著低于对照组（P〈0．01），而空白对照组及空质粒组无明显差异（P〉0．05）。结论 应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低乳腺癌MCF-7细胞STAT3的表达，进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡。     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

血管生成抑制素对胃癌细胞的影响

目的探讨血管生成抑制素对胃癌细胞增殖和游走的影响及对胃癌细胞分泌血管内皮生长因子A和C(VEGF-A和VEGF-C)的影响并分析其作用机制。方法采用MTT法和划线法观察0、0.5、1.0、1.5μg/ml浓度的血管生成抑制素对胃癌细胞增殖和游走的影响。免疫组化的方法检测0、0.5、1.0、1.5μg/ml浓度的血管生成抑制素对胃癌细胞内血管内皮生长因子(VEGF)-A和VEGF-C的影响。结果 MTT法显示不同浓度的血管生成抑制素对胃癌细胞增殖无明显影响(p0.05),同样,划线法测得的胃癌细胞迁移距离同对照组相比无明显差异(p0.05)。但免疫组化法结果显示,0.5、1.0、1.5μg/ml浓度的血管生成抑制素组胃癌细胞VEGF-A和VEGF-C的表达同对照组相比明显减少(p0.05)。结论血管生成抑制素明显减少胃癌细胞内的VEGF-A和VEGF-C的分泌,但对胃癌细胞的增殖和游走无明显作用。     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

Relaxin promotes differentiation of human breast cancer cells MCF-7 transplanted into nude mice

Previous studies showed that the hormone relaxin acts on human breast cancer MCF-7 cells in vitro by modulating cell proliferation and promoting cell differentiation toward a duct epithelial phenotype. The present study was designed to investigate whether relaxin retains these properties when acting in vivo on MCF-7 cell tumors developed in athymic nude mice. Mice bearing MCF-7 cell tumors transplanted under the mammary fat pad and estrogenized to sustain tumor growth were treated systemically with relaxin (10 μg/day) for 19 days. Vehicle-treated mice were used as controls. Thirty days later, the mice were sacrificed and tumor fragments were analyzed by light and electron microscopy and immunocytochemistry. Measurements of tumor volume were recorded weekly for the overall experimental period. The results obtained indicate that relaxin treatment promotes differentiation of tumor cells towards both myoepithelial-like and epithelial-like cells, as judged by the ultrastructural features of the cells and by the increased expression of smooth muscle actin and cadherins. Measurements of tumor size and of the number of cycling cells show that relaxin, at the doses and times of exposure used in this study, does not significantly influence tumor growth and cell proliferation. Received: 3 March 1999 / Accepted: 28 May 1999     

RNA干扰FABP5基因对人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的:研究脂肪酸结合蛋白5(FABP5)基因沉默的慢病毒载体对人肝癌Hep G2细胞成瘤效应的影响。方法:采用RNA干扰技术构建重组逆转录慢病毒载体。Hep G2细胞分为3组:实验组以FABP5基因沉默慢病毒颗粒(LV-shRNA-FABP5)感染Hep G2细胞;阴性对照组以空载体慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染Hep G2细胞;空白对照组不做任何处理。将裸鼠随机分为3组,接种肿瘤细胞后观察裸鼠成瘤情况。4周后测量肿瘤的体积和重量,绘制移植瘤生长曲线。Real-time PCR、Western blot及免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤中FABP5的表达。结果:LV-shRNA-FABP5可以降低Hep G2细胞FABP5的表达。3组裸鼠接种癌细胞后均有肿瘤形成。与空白对照组和阴性对照组相比,实验组肿瘤生长速度明显减慢,且体积及重量明显减小(P0.05);实验组裸鼠肝癌移植瘤组织的FABP5 mRNA和蛋白表达水平相比空白对照组和阴性对照组表达明显下降(P0.05)。结论:沉默FABP5基因表达能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长。FABP5可能成为肝癌基因治疗的一个有效靶点。     

RNA干扰Slug基因对HCT116细胞裸鼠移植瘤生长及转移的影响

目的：探讨通过靶向RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Slug基因的表达,观测对荷瘤裸鼠结直肠癌生长及转移的影响。方法：利用结肠癌细胞株HCT116对24只5周龄裸鼠皮下种植,建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,设立空白对照组、阴性对照组及实验组三组,每组8只。分别注射生理盐水、阴性对照质粒及慢病毒载体,观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,观察各组间肿瘤生长及淋巴结转移的变化,应用免疫组化、qRT-PCR和Western blot检测Slug基因和蛋白表达情况。结果：Slug基因shRNA实验组与空白对照组和阴性对照组相比,瘤体生长减缓,移植瘤质量明显减小（3.08±0.31 vs 7.37±1.18,7.46±1.16,P＜0.01）,Slug蛋白表达明显降低（P＜0.05）;实验组淋巴结阳性率为36.3％（4/11）,与阴性对照组77.8％（14/18）及空白对照组68.4％（13/19）相比较（P＜0.01）。结论：靶向Slug的RNA干扰可以显著抑制结肠癌裸鼠模型的生长、淋巴结转移以及癌组织中Slug基因蛋白的表达,可能成为结肠癌基因治疗的潜在分子靶点。     

In-vitro inhibitory effect of EGFL7-RNAi on endothelial angiogenesis in glioma

Objective: To investigate the role and mechanism of epidermal growth factor like domain 7 (EGFL7) in glioma angiogenesis by cell co-culture and RNA interference. Methods: NSCs-HUVECs co-culture system was established using Transwell culturing techniques. The interactions between glioma and endothelial cells were simulated in-vitro. Cellular expression of EGFL7 in NSCs and HUVEC was targeted and suppressed by lentiviral vector carrying siRNA. The effect of EGFL7 on angiogenesis in glioma in-vitro micro-environment was detected by endothelial cell proliferation, adhesion and tube formation assay. Results: Following EGFL7 gene silencing, expression of EGFL7 in HUVECs was reduced and cell adhesion capability was inhibited significantly. Endothelial cells failed to form a lumen-like structure after EGFL7 gene silencing, shown by the tube formation assay. Conclusion: By regulating endothelial cell adhesion, EGFL7 plays a key role in the regulation of glioma angiogenesis.     

Survivin-siRNA真核重组质粒对前列腺癌移植瘤的抑制作用

 目的：探讨survivin-siRNA真核重组质粒对前列腺癌移植瘤的抑瘤效应,并分析相关机制。方法：体外培养前列腺癌DU145细胞,将细胞注射到裸鼠背部皮下,待移植瘤直径达到8 mm时将瘤无菌取出,分成直径约2 mm的瘤块,手术植入另外的裸鼠皮下,将survivin-siRNA质粒或scrambled siRNA对照质粒电转染进行治疗,描记移植瘤生长曲线,并计算抑制率;通过HE染色、免疫组化染色及TUNEL染色观察survivin-siRNA对移植瘤影响。结果：成功构建裸鼠前列腺癌移植瘤模型。与mock和scrambled siRNA组相比,survivin-siRNA抑瘤率分别为两对照组的61.81%和62.87%;免疫组织化学染色发现：survivin-siRNA质粒明显抑制细胞内survivin表达;TUNEL染色证实治疗组肿瘤细胞凋亡明显增加。结论：重组质粒survivin-siRNA明显抑制DU145细胞移植瘤的生长,抑制内源性 survivin 蛋白的表达并促进细胞凋亡,针对survivin靶点的基因治疗前景广阔。     

介导RNAi的tRNAVal启动子质粒载体的建立

目的 构建以tRNA^Val启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体。方法 从人基因组中用PCR方法扩增出tRNA^Val基因片段，人工突变去除3′末端数个碱基，连以Linker序列，用此经过改造的tRNA^Val启动子，构建控制针对荧光素酶的shRNA转录载体pUC-tRNA^Val lueRi，与pMAMneoLuc共转染BHK-21细胞，观察对荧光素酶表达的影响。结果 pUC-tRNA^Val lucRi可以高效特异性抑制pMAMneoLuc中荧光素酶的表达，效率达97．1％～99．5％。结论 tRNA^Val启动子载体可以高效转录shRNA，引发哺乳动物细胞RNAi现象。