KU-55933抑制替莫唑胺诱导的U87胶质瘤细胞自噬

目的研究KU-55933对替莫唑胺(TMZ)诱导的U87细胞自噬及TMZ毒性的影响及机制。方法 U87细胞分别给予5、10、15、20μmol/L KU-55933作用72 h,或10μmol/L KU-55933作用24、48、72、96 h,MTT法检测细胞增殖。U87细胞分别给予DMSO、100μmol/L TMZ、10μmol/L KU-55933、100μmol/L TMZ+10μmol/L KU-55933作用72 h,流式细胞术检测自噬小体,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 KU-55933抑制U87细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性;KU-55933抑制TMZ诱导的共济失调突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)、自噬激活激酶(unc-51 like autophagy activating kinase1,ULK1)、P53蛋白磷酸化,降低微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)裂解,减少自噬小体的生成,增加TMZ敏感细胞组蛋白亚型γH2AX的形成,但对细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,Chk2)蛋白磷酸化无影响。结论 KU-55933可抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞自噬,并且增强TMZ对敏感胶质瘤的细胞毒性。     

Survivin对体外培养胶质瘤细胞U251替莫唑胺敏感性的影响

目的探讨Survivin对体外培养的人脑胶质瘤细胞(U251)替莫唑胺化疗敏感性的影响。方法将人脑胶质瘤细胞U251中Survivin的表达上调或者抑制后,经替莫唑胺处理。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,平板克隆形成试验评价各组细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法检测各组细胞激活caspase-3的表达情况。结果替莫唑胺处理后,与亲代细胞相比,下调Survivin的表达,细胞的生长抑制效果增强,凋亡率增加,激活的caspase-3蛋白表达增多;上调Survivin的表达,细胞生长抑制作用减弱,凋亡率减少,激活的caspase-3蛋白表达下降。结论 Survivin可通过抑制凋亡,影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。     

硼中子俘获疗法诱导U87胶质瘤细胞凋亡

目的 探讨硼中子俘获疗法(BNCT)对人脑胶质瘤细胞株U87的增殖抑制和诱导凋亡的作用及可能机制.方法 实验分为未照射组(0 Gy)、γ射线对照组(4、8 Gy)、反应堆组(3.5 Gy)、BNCT组(4、8 Gy).采用形态观察、流式细胞仪Annexin V/PI荧光染色、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法等方法观察BNCT对U87细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用,以免疫组织化学技术检测P53蛋白的表达,应用western blot检测BCL-2、BAX蛋白表达的变化.结果 硼中子照射后细胞出现典型的凋亡形态改变.BNCT 4、8 Gy组处理后48 h细胞的凋亡率分别为65.1%、85.9%.BNCT 4、8 Gy组细胞生长抑制作用显著高于同等剂量的γ射线照射组(P＜0.01).未照射的U87细胞P53蛋白表达阴性,BNCT4、8 Gy照射后P53蛋白表达阳性.BNCT4、8 Gy照射后BCL-2蛋白表达下降,BAX蛋白上升.结论 BNCT对U87细胞具有显著的增殖抑制作用,并有剂量、时间依赖性特点.     

反义miR-30a-5p抑制人脑胶质瘤细胞U87生长的体外实验研究

目的 前期发现miR-30a-5p在胶质瘤中表达明显上调,本实验探究敲低miR-30a-5p对人脑胶质瘤细胞U87细胞生物学特征的影响.方法 real-time PCR检测转染miR-30a-5p I(miR-30a-5p抑制物)后U87细胞的miR-30a-5p表达水平,流式细胞术、MTT、Transwell、Annexin V法检测细胞周期、生长、侵袭及凋亡的改变;Western blot检测相关蛋白.结果 real-time PCR结果显示miR-30a-5p I可有效降低U87细胞中miR-30a-5p表达,抑制细胞增殖活性,使细胞周期阻滞在G0/G1期,侵袭能力明显受抑,凋亡增加,促增殖蛋白PCNA、促细胞周期进展蛋白Cyclin D1及促侵袭蛋白MMP-9的表达明显下调,而抑制侵袭蛋白TIMP-1及凋亡相关蛋白p53表达明显上调.结论 敲低U87细胞的miR-30a-5p表达可抑制胶质瘤的增殖及侵袭,诱导凋亡;miR-30a-5p可成为人脑胶质瘤基因治疗的潜在候选靶点.

Abstract：

Objective Our previous study had shown that there was overexpression of miR- 30a- 5p in malignant glioma cell lines.In the present study, we aim to investigate the effect of knocking -down miR -30a -5p on the biological characteristics of U87 glioblastoma cells.Method The U87 cells were divided into three groups:control cells,cells transfected with scramble oligonucleotides and cells transfected with miR -30a -5p inhibitors(miR-30a-5p I).Oligonucleotides mediated by lipofectamine were transfected to U87 cells.Real -time PCR was conducted to detect the expression of miR- 30a -5p in transfected cells.The cell proliferation was determined by 3- (4,5- Dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.The cell invasion was evaluated by Transwell assay and cell apoptosis was detected with Annexin V staining Moreover, the relevant molecules regulating proliferation, invasion, cell cycle progression and apoptosis were examined by Western blot analysis.Results The expression of miR - 30a - 5p in the cells transfected with miR - 30a - 5p I was significantly reduced.The cell proliferation activity of U87 cell was inhibited.The cell cycle was arrested in G0/G1 phase, cell invasive ability was attenuated and apoptotic cells were increased in cells transfected with miR -30a -5pI as compared to those of the cells transfected with scrambled siRNA and control cells.The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), matrix metallopeptidase 9 ( MMP - 9) and Cyclin D1 were downregulated while the tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP - 1 ) and p53 were upregulated.Conclusions Transfection of miR - 30a-5p I into glioma cells could inhibit the proliferation activity and invasive ability of U87 cell and induce cell apoptosis, miR -30a -5p is a potential target of gene therapy for glioma.     

白藜芦醇诱导U87胶质瘤细胞凋亡及caspase-3的激活

目的探讨白藜芦醇(Res)抑制体外脑胶质瘤细胞系U87生长并诱导其凋亡,激活 caspase-3的作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制不同浓度Res作用6 h、24 h、48 h后的细胞生长曲线,流式细胞仪Annexin V—FITC和PI双染检测凋亡率,Hoechst 33342荧光染色及透射电镜 (TEM)观察细胞增殖改变:Western-blot分析caspase-3酶原的变化,半定量RT—PCR检测caspase-3 mRNA水平的改变,比色法测定caspase-3的相对活性。结果 Res明显抑制U87细胞的增殖 (P<0．01),呈浓度及时问依赖性反应;Res可诱导U87胶质瘤细胞凋亡并呈浓度依赖关系。用不同浓度 Res处理U87细胞24 h,随药物浓度增加,caspase-3酶原的蛋白水平减少,caspase-3 mRNA水平增加 (P<0．01)。用200 μmol／L Res分别处理细胞0．5、2、6、12、24 h,caspase-3活性于2 h开始升高,12 h达高峰(P<0．01);用不同浓度的Res处理细胞12 h,caspase-3活性呈浓度依赖性的升高(P<0．01)。结论 Res明显抑制U87细胞生长并诱导其发生凋亡,凋亡过程中有caspase-3的激活。     

沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞机制的体外研究

目的 对沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞的机制进行体外研究,为制订沙利度胺与替莫唑胺联合化疗方案提供理论依据.方法 经体外培养的人胶质瘤细胞系U251分别接受替莫唑胺(100 μmol/L)、沙利度胺(100 μg/L)、替莫唑胺与沙利度胺联合治疗,噻唑监(MTT)法检测不同抗肿瘤药物处理组肿瘤细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞增殖周期;检测经吖啶橙标记的酸性囊性细胞器数目;原位末端标记(TUNEL)法观察肿瘤细胞凋亡情况;Western blotting法榆测肿瘤自噬及凋亡相关蛋白表达变化.结果 与替莫唑胺和沙利度胺单药治疗相比,替莫唑胺与沙利度胺联合治疗对U251细胞生长的抑制更为明显(均P=0.000).且可诱导肿瘤细胞周期阻滞于G0～G1期,以及发生凋亡和自噬.两药联合治疗后,U251细胞微管相关蛋白1轻链3和Caspase-3表达水平高于替莫唑胺组和沙利度胺组(均P=0.000).结论 沙利度胺联合替莫唑胺治疗U251细胞可以上调自噬及凋亡相关基因表达水平.同时诱导凋亡及自噬性死亡,从而达到对U251胶质瘤细胞的杀伤作用.     

替莫唑胺对人胶质瘤细胞系U251细胞miR125b的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)对人胶质瘤细胞系U251细胞的miRNA125b的表达影响。方法将人胶质瘤细胞系U251细胞分成空白对照组、TMZ组,TMZ组设10、25、50、100、200、400、600μmol/L组。各组分别作用于24、48、72 h后进行实时定量PCR(Real-time PCR)检测miRNA-125b的表达水平;用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果荧光定量PCR检测结果显示:替莫唑胺作用24 h后,miRNA125b表达变化不明显;48 h后对miR-125b表现出抑制作用,miR-125b对U251细胞的抑制率呈良好的时间-剂量效应关系,其Ic50为76μmol,初始抑制浓度为50μmol;流式细胞仪检测显示,U251细胞经TMZ作用后出现G2/M期阻滞,但促凋亡作用并不显著。结论在TMZ对胶质瘤细胞治疗过程中,hsa-miR-125b的表达随着治疗剂量而被抑制,miR-125b可以作为TMZ在用药过程中效果的检测以及抗药性反应的参考依据。     

华蟾素诱导人胶质瘤U87细胞凋亡的作用机制研究

目的 探讨华蟾素(Cinobufacini)对人胶质瘤U87细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U87细胞分为对照组、华蟾素组(依华蟾素水平不同分为3个亚组),MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,透射电镜观察细胞形态学的变化,Western blot法检测胶质瘤U87细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平。结果 华蟾素对胶质瘤U87细胞增殖有抑制作用; 流式细胞仪及Hoechst 33258核染色法的检测显示,随着华蟾素作用浓度的递增,胶质瘤U87细胞凋亡率呈剂量依赖性递增; 华蟾素作用后可使Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平升高。结论 华蟾素通过改变Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平来抑制胶质瘤U87细胞增殖并促进其凋亡。     

姜黄素诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞增殖的研究

目的研究姜黄素对脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用及机制。方法采用10、20、40、60、80μmol/L姜黄素分别处理U87细胞72h后,MTT法检测姜黄素对U87细胞增殖的影响。流式细胞术检测40μmol/L姜黄素处理前后U87细胞周期和凋亡变化。提取40μmol/L姜黄素处理前后不同时间点U87细胞总蛋白,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3的表达。结果姜黄素呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖(P0.05),半数抑制浓度(IC50)为42.44μmol/L。姜黄素诱导G2-M期细胞周期阻滞,实验组G2-M期细胞比例为(47.71±2.67)%,对照组为(17.96±0.88)%(P0.01);实验组细胞凋亡率为(3.93±0.82)%,对照组为(1.80±0.65)%,两组差异无统计学意义(P0.05)。姜黄素给药12、24、48h,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为(0.89±0.004)、(0.93±0.01)、(1.09±0.02),高于对照组(0.76±0.04)(P0.05);3-MA能减弱姜黄素对U87细胞增殖的抑制作用。结论姜黄素通过诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖。     

替莫唑胺通过TFRC抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 探讨转铁蛋白受体（TFRC）在替莫唑胺抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用。方法 体外培养U87胶质瘤细胞,加入50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L替莫唑胺作用;构建control siRNA、siTFRC转染U87细胞沉默TFRC表达,构建pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1/TFRC转染U87细胞过表达TFRC;利用CCK-8方法检测U87细胞增殖;利用Transwell小室实验检测U87细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检查U87细胞TFRC mRNA和蛋白表达。结果 与空白组相比,替莫唑胺处理后,U87细胞的增殖和侵袭能力显著下降（P<0.05）,TFRC mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,当替莫唑胺浓度为200 μmol/L时,对U87细胞的抑制能力最强（P<0.05）。当利用pcDNA3.1/TFRC过表达U87细胞TFRC处理后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著下降（P<0.05）;而当利用siTFRC沉默U87细胞TFRC表达后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著增强（P<0.05）。结论 替莫唑胺可能通过抑制TFRC的表达而抑制U87胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

过表达miR-21通过PI3K-AKT 通路抑制替莫唑胺对胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用

目的 探讨miR-21 过表达在替莫唑胺(TMZ)诱导胶质瘤U87 细胞增殖中的作用及其机制,明确miR-21 过表达在替莫唑胺临床治疗胶质瘤耐药中的作用.方法 Pre-miR-21 过表达载体转染U87 细胞,通过形态学观察,噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖情况.Western 印迹验证Akt 和p-Akt 表达及检测PI3K 活性.结果 替莫唑胺可显著抑制U87 细胞生长,下调Akt 和p-Akt 表达及抑制PI3K 活性.U87 细胞预转染pre-miR-21 过表达载体后,替莫唑胺的这种效应可部分被miR-21 过表达所抑制.结论 miR-21 过表达可通过活化PI3K-AKT 通路部分抑制替莫唑胺诱导的U87 细胞凋亡,提示胶质瘤中miR-21 过表达可能是替莫唑胺临床治疗胶质瘤药物抵抗的一大新的因素.     

P57对U87胶质母细胞瘤细胞系增殖的抑制作用及对替莫唑胺化疗损伤的抵抗作用

目的 探讨替莫唑胺(TMZ)短期化疗下P57在胶质母细胞瘤细胞增殖抑制中的作用和机制. 方法 通过Western blotting检测P57和核增殖抗原(Ki-67)在TMZ短期化疗后U87细胞中的表达情况;通过Western blotting和免疫组化染色比较原发性和复发性(经TMZ治疗)胶质母细胞瘤临床标本中P57的表达差异;通过干扰P57的表达,检测TMZ短期化疗下和撤药后U87细胞凋亡、细胞周期和细胞活力的变化. 结果 TMZ短期化疗后,U87细胞中P57蛋白表达量明显升高,而Ki-67表达量明显下降;胶质母细胞瘤临床标本中复发性肿瘤的P57表达量高于原发性肿瘤;干扰P57表达后周期素依赖性激酶2(Cdk2)的表达量增加,表现为TMZ对U87细胞的增殖抑制作用减弱,但细胞凋亡率明显升高(未干扰细胞凋亡率为12.83％±1.40％,干扰组细胞凋亡率为31.00％±3.48％);此外,撤药后,与对照组相比,P57干扰组U87细胞发生明显细胞周期阻滞和细胞活力下降. 结论 TMZ短期化疗下,U87细胞通过上调P57表达及下调Cdk2表达抑制肿瘤细胞增殖,同时通过抑制细胞周期进程以降低化疗损伤.     

白藜芦醇对脑胶质瘤U87细胞及干细胞凋亡诱导作用

目的比较研究白黎芦醇(Res)对人脑胶质瘤U87细胞及其胶质瘤干细胞(GSC)的作用。方法膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)和碘化丙啶(PI)染色法测定细胞凋亡;CD133标记、CD133与AnnexinⅤ/PI共标记检测GSC相对含量及GSC的凋亡;实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mdr1基因mRNA表达,流式细胞术(FCM)测定P-糖蛋白(P-gp)的表达;集落形成法(CFU)检测细胞的自我更新和增殖能力。结果不同浓度的Res显著诱导U87细胞凋亡,抑制U87细胞集落的形成。40～160μmol/L Res作用后U87细胞群体中CD133+GSC相对含量显著增高、GSC凋亡细胞数量增加,但GSC对Res的敏感性低于U87群体细胞。Res诱导后U87细胞群体中高表达mdr1/P-gp的细胞显著增高,并与GSC含量的增高基本相一致。结论白黎芦醇可诱导脑恶性胶质瘤U87群体细胞及其干细胞凋亡。     

塞来昔布联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞作用研究

目的探讨环氧合酶抑制剂塞来昔布联合抗肿瘤药物替莫唑胺对神经胶质瘤细胞系U251细胞的体外抗瘤效应及其可能机制。方法分别使用塞来昔布、替莫唑胺和两者联合用药干预U251细胞;显微镜下观察细胞形态学变化;以甲基噻唑基四唑比色法检测药物对U251细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察药物对U251细胞迁移能力的影响;采用膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶双染色通过流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响;Western Blot法检测药物对U251细胞中Bcl-2和Bax表达的影响。结果药物处理后,U251细胞出现明显的形态学改变,以联合用药组细胞最为显著;当塞来昔布与替莫唑胺联合应用时,显著增强替莫唑胺对U251细胞增殖的抑制效应,抑制细胞迁移,并促进其凋亡;塞来昔布和替莫唑胺联合作用后,U251细胞Bax表达增高、Bcl-2表达降低。结论塞来昔布和替莫唑胺联合应用可以协同抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡;其促进细胞凋亡的机制可能与Bax表达的上调以及Bcl-2表达的下调有关。     

脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的构建及其对替莫唑胺的耐药性研究

目的探讨脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的体外构建方法并研究其对替莫唑胺的耐药性。方法通过慢病毒感染实验观察带有不同荧光标记的人脑胶质瘤U251细胞;采用植物血凝素-聚乙二醇融合法进行细胞融合;通过流式细胞分选实验检测体外携带双色荧光标记的胶质瘤多倍体巨细胞;采用碘化丙啶染色方法测定U251融合克隆细胞的DNA含量;通过CCK-8实验评价细胞的增殖率以及加入替莫唑胺后细胞的存活率。结果慢病毒感染实验成功获得分别带有绿色和红色荧光标记的胶质瘤U251细胞;细胞融合后显微镜下可见携带双色荧光的胶质瘤融合细胞,并且与聚乙二醇细胞融合法比较,植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法的细胞融合率明显提高(自<1%提高至>5%)。流式细胞分选获得胶质瘤U251融合细胞单克隆株。DNA含量的检测结果显示,U251融合克隆细胞的DNA含量自之前的2N/4N提高至4N/8N。CCK-8实验结果显示,U251细胞接种后1、2、3、4及5 d的细胞增殖率分别为(99.5±2.6)%、(236.7±4.7)%、(348.9±8.8)%、(656.5±18.5)%及(715.7±48.2)%;而U251-C1多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.6±2.1)%、(114.5±1.3)%、(138.4±1.7)%、(316.7±23.1)%及(347.7±13.1)%,U251-C2多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.3±1.2)%、(114.7±1.2)%、(186.4±0.6)%、(307.1±9.5)%及(432.9±37.7)%,相较于胶质瘤U251细胞,U251多倍体巨细胞的不同克隆株(U251-C1、U251-C2)的增殖速度均明显减慢(均P<0.05)。替莫唑胺作用下,U251细胞和U251多倍体巨细胞(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均下降(均P<0.01),而与U251细胞组比较,不同U251多倍体巨细胞株(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均更高(均P<0.01)。结论植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法可在体外成功构建脑胶质瘤U251多倍体巨细胞;胶质瘤U251多倍体巨细胞可能对替莫唑胺的耐药性发挥重要作用。     

敲低miR221/222上调PUMA促进胶质母细胞瘤U251细胞凋亡的体内研究

目的 探讨敲低miR-221/222表达上调PUMA对U251人脑胶质母细胞瘤凋亡的影响及其机制. 方法 5周龄BALB/c裸鼠左侧鼷部皮下接种1 mm3移植胶质瘤瘤块建立裸鼠移植瘤模型,1周后接受治疗(转染无义序列组、反义miR-221/222共转染组分别瘤内注射无义对照序列、反义miR-221/222寡核苷酸,对照组注射等量溶剂,每组8只).治疗开始至28 d观察肿瘤的生长情况,观察期结束时取肿瘤组织HE染色检测病理学改变;荧光原位杂交(FISH)、实时定量PCR检测肿瘤组织miR-221、miR-222的表达;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡,免疫组化染色、Western blotting检测肿瘤组织凋亡相关蛋白PUMA、bax和bcl-2、p53的表达. 结果 治疗后6～28 d反义miR-221/222共转染组移植瘤的体积明显低于对照组和转染无义序列组,差异有统计学意义(P＜0.05);与转染无义序列组及对照组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织miR-221、miR-222 mRNA的表达水平下降;HE染色显示反义miR-221/222共转染组肿瘤组织异型性减低,新生血管数减少;与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织的凋亡指数较高,差异有统计学意义(P＜0.05);免疫组化染色检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组PUMA、bax表达阳性率较高,bcl-2表达阳性率较低,差异有统计学意义(P＜0.05); Western blotting检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织PUMA和bax蛋白表达升高,bcl-2表达下降,而p53表达无明显变化. 结论 反义miR-221/222治疗可通过上调PUMA蛋白表达来诱导U251胶质瘤细胞凋亡.     

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

恶性胶质瘤耐药细胞通过Beclin1上调自噬抵抗替莫唑胺化疗

目的 分析Beclin 1与临床胶质瘤病理等级和胶质瘤复发间的关系,探讨其在胶质瘤耐药中的作用和机制. 方法 收集南方医科大学珠江医院和南方医院神经外科自2012年4月至2013年4月手术切除的胶质瘤标本53例(WHO分级Ⅰ级7例,复发2例;Ⅱ级9例,复发4例;Ⅲ级11例,复发6例;Ⅳ级9例,复发5例),免疫组化和Western blotting检测胶质瘤标本中Beclin1的表达;体外培养胶质瘤耐药细胞系U251AR和非耐药U251细胞,Western blotting检测细胞中Beclin 1和耐药蛋白P-gP的表达;Western blotting检测双链小分子Beclin 1干扰RNA(siBeclin l)转染U251AR细胞48h后Beclin 1蛋白的表达;CCK8法检测不同浓度替莫唑胺(TMZ)作用U251、U251AR和U251AR-siBeclin 1后细胞活性;Western blotting检测200μmol/L TMZ作用U251、U251AR和U251AR-siBeclin 1 48 h后Capase-3的表达;吖啶橙染色和Western blotting分别检测干扰Beclin 1表达和HCQ对U251AR细胞自噬小体数量和Capase-3表达的影响. 结果 免疫组化染色结果显示Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中Beclin 1阳性细胞数明显高于Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤.Western blotting结果显示Ⅳ级、Ⅱ和Ⅲ级、Ⅰ级中Beclin 1的表达依次降低,Ⅲ、Ⅳ级复发肿瘤Beclin 1的表达量明显高于原发肿瘤,差异有统计学意义(P＜0.05); U251AR中Beclin 1和耐药蛋白P-gP的表达量均高于U251细胞.与干扰对照组和空白对照组比较,转染siBeclin 1 48 h后干扰组Beclin 1蛋白的水平明显下降;在含TMZ(50,100,500和1000 μmol/L)培养基中培养24 h后,U251AR细胞存活率明显高于U251和si-Bec1-U251AR细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).200 μmol/L TMZ作用48 h后,U251细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达量明显高于U251AR和si-Bec l-U251AR细胞.吖啶橙染色显示在TMZ培养U251AR 48 h后,HCQ和Beclin 1干扰都导致自噬小体形成明显减少,Caspase-3的表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Beclin 1与胶质瘤恶性程度、复发和耐药相关,可能用于胶质瘤恶性诊断和预后评估.Beclin 1在胶质瘤中的耐药功能可能是通过自噬实现的,联合运用TMZ和自噬抑制剂或Beclin 1干扰剂有助于胶质瘤的治疗.