基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4对人骨髓间充质干细胞向

背景：近年研究发现移植的骨髓间充质干细胞能向颅内创伤、脑卒中、炎症和变性疾病等病灶部位迁移,进而发挥治疗作用,但对于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：探讨基质细胞衍生因子1及其受体 CXCR4在移植的骨髓间充质干细胞趋向缺血脑组织迁移中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行。 材料：骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15~40岁正常或原发病未累及骨髓患者,三四月龄健康雄性SD大鼠72只由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化、体外培养人骨髓间充质干细胞。54只大鼠参照Nagasawa线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,剩余18只作为假手术组,仅插入线栓10 mm。模型组及假手术组大鼠各取9只,分别于造模后第2,4,8天,采用Real-time PCR和免疫组织化学法定量分析缺血脑组织基质细胞衍生因子1表达变化。剩余36只脑缺血再灌注模型鼠随机分为细胞移植组、溶液对照组,18只/组,于再灌注后24 h分别从尾静脉缓慢注入1 mL人骨髓间充质干细胞悬液(含2×109 L-1个细胞)或1 mL PBS。 主要观察指标：人骨髓间充质干细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达,缺血再灌注后脑组织基质细胞衍生因子1 mRNA和蛋白表达变化,免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞向缺血脑组织的迁移和分布。 结果：RT-PCR结果发现人骨髓间充质干细胞表达CXCR4 mRNA,免疫细胞化学染色发现CXCR4主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆。脑缺血再灌注损伤后2,4,8 d,趋化因子基质细胞衍生因子1 mRNA水平呈上升趋势,与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。经静脉移植的人骨髓间充质干细胞定向迁移到脑损伤区域,并大量分布于基质细胞衍生因子1高表达的缺血半暗区,损伤侧大脑半球人骨髓间充质干细胞数量显著高于对侧半球(P < 0.01)。 结论：基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4参与并促进人骨髓间充质干细胞向脑缺血再灌注损伤区的迁移。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响*

背景：缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的。 目的：观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响。 方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3~5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达。将骨髓间充质干细胞分四组：常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h)。RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子 mRNA表达水平, ELISA检测骨髓间充质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平。 结果与结论：同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1 α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P < 0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P < 0.05)。证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素。     

软骨损伤后基质细胞衍生因子1的表达

目的：研究骨髓间充质干细胞趋化聚集软骨损伤病灶的可能机制,为调控和干预软骨损伤时干细胞定向迁移和聚集提供理论和实验依据。方法：制作兔软骨损伤模型,分别于制模后2、5、7、10、14、28天处死兔子,取损伤灶及边缘区组织,利用组织裂解液提取总蛋白,分别行酶联免疫法夹心法检测SDF-1表达和体外细胞迁移实验,部分兔软骨损伤制模成功后,行细胞体内移植,观察SDF-1对MSCs、软骨细胞的迁移影响。结果：SDF-1的表达呈现出时间变化的趋势,制模后7天达到高峰水平。制模后的软骨组织对MSC迁移的影响与SDF-1的表达呈相同的变化程序,制模后7天对MSC的趋化作用最强。SDF-1 存在时,MSCs 迁移活跃,应用抗体封闭CXCR4 后,这种迁移显著减弱。体内移植的MSCs主要聚集在损伤灶周围,但在封闭CXCR4 后,这种聚集现象大大减弱。结论：软骨损伤的早期,损伤灶内修复组织中SDF-1的表达明显升高,并可在损伤后2周内维持在一个相对高的水平,软骨损伤灶内SDF-1表达量上调是吸引骨髓干细胞归巢的可能机制之一,通过调节基质细胞源性因子1及其受体CXCR4对MSCs的趋化作用,可望调控干细胞向靶组织的趋化聚集量,达到治疗目的。     

胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞的归巢机制

背景：间充质干细胞移植后是否成功,依赖于经静脉输注后能否定居于靶器官并长期存活,这个过程被称为归巢。然而,调节和控制间充质干细胞归巢的分子机制目前尚不十分清楚。 目的：探讨胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢的机制,观察基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4对干细胞归巢效率的影响,摸索提高其归巢和长期植入效率的方法。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2005-09/2006-07在中国医学科学院、中国协和医科大学组织工程中心完成。 材料：Flk1+骨髓间充质干细胞来源于流产胎儿,由天津医科大学第二附属医院妇产科提供。6~8周龄NOD/SCID小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。 方法：采用流式细胞仪、实时定量PCR等方法检测特定细胞因子刺激前后Flk1+间充质干细胞CXCR4表达和体外迁移能力的变化。NOD/SCID小鼠预先经全身亚致死量照射后,从尾静脉输入经或未经细胞因子刺激的Flk1+间充质干细胞,对照组注射等体积生理盐水。移植后24 h,应用流式细胞仪分析骨髓中供体细胞的含量,或在移植后定期从小鼠的尾静脉取血,分析外周血中白细胞、红细胞及血小板的数量变化。移植后6个月,实时定量PCR法检测小鼠骨髓中的人特异性DNA含量,了解人源细胞的植入情况。 结果：Flk1+间充质干细胞的胞浆中有CXCR4表达,在适当细胞因子刺激下,能够在短时间内被诱导至细胞表面表达。通过24 h短时间细胞因子刺激,不仅能够上调细胞表面及内部的CXCR4,而且可以增加细胞在体外沿基质细胞衍生生长因子1浓度梯度迁移的活性,促进细胞植入经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠体内后向骨髓的归巢及长期存活,同时也加快了受体小鼠的造血恢复;用CXCR4中和抗体处理的Flk1+间充质干细胞,则明显减少其移植后在受体小鼠中的归巢和植入。 结论：基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4在Flk1+间充质干细胞迁移和归巢中发挥着重要作用,增加细胞表面CXCR4的表达,有助于促进Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢和加快受体造血恢复。     

骨髓间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者T细胞活化的影响

背景：骨髓间充质干细胞具有免疫调节作用,可治疗自身免疫性疾病。 目的：探讨在体外人骨髓间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者T细胞活化的影响。 方法：分离、培养人骨髓间充质干细胞,培养至第3代以后的细胞胰蛋白酶消化后用流式细胞仪确定其浓度,按照不同浓度将骨髓间充质干细胞设为1×108,1×107L-1两组。取肝素抗凝新鲜27例系统性红斑狼疮患者患者外周血10 mL,分离培养T淋巴细胞,以1×109 L-1的细胞浓度,100 µL/孔,接种两组骨髓间充质干细胞上,以单纯统性红斑狼疮患者的T淋巴细胞作为对照组。通过流式细胞术计算CD3+ T细胞CD25(IL-2R)和CD38细胞的表达率。 结果与结论：与对照组比较,1×108 L-1浓度组的骨髓间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者CD25及CD38的表达呈明显抑制作用(P < 0.01),1×107 L-1浓度组,无明显变化。结果表明：骨髓间充质干细胞抑制系统性红斑狼疮患者T细胞的活化,且对这种抑制作用具有数量依赖性。     

基质细胞衍生因子-1对间质干细胞迁移的影响

目的:观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在体内外对大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的趋化诱导作用,探讨SDF-1对rMSCs迁移影响的可能机制。方法:应用体外细胞迁移实验及大鼠脑梗死模型体内移植,观察SDF-1对rMSCs的迁移影响。流式细胞术与RT-PCR检测rMSCs的CXC趋化因子受体4(CXCchemokinereceptor4,CXCR4)表达。结果:在SDF-1存在时,rMSCs迁移活跃,应用抗体封闭CXCR4后,这种迁移显著减弱。体内移植的rMSCs主要聚集在脑梗死灶周围,但在封闭CXCR4后,这种聚集现象大大减弱。流式细胞术示仅小部分rMSCs表面表达CXCR4,但经TritonX-100处理后,表达CXCR4的rMSCs增加。结论:SDF-1可通过CXCR4对rMSCs起趋化作用,针对这种作用可望调控干细胞向靶组织的趋化聚集量,达到治疗目的。     

基质细胞衍生因子1α及受体CXCR4对颈总动脉球囊损伤血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞的影响

背景：在细胞因子的作用下,骨髓基质细胞可以向内皮祖细胞分化,并迁移至损伤部位增殖,参与血管新生内膜的修复。 目的：观察基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4在大鼠颈总动脉球囊损伤后对血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞的影响。 方法：体外培养大鼠颈总动脉球囊损伤后各时间点(即刻、1,4,7,14及1个月)的血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞,检测损伤后平滑肌细胞中基质细胞衍生因子1α及骨髓基质细胞中CXCR4的表达情况,并应用基质细胞衍生因子1α siRNA转染损伤后血管平滑肌细胞,同时应用transwell 小室观察基质细胞衍生因子1α和损伤后血管平滑肌细胞对骨髓基质细胞的趋化作用。 结果与结论：大鼠颈总动脉球囊损伤后,平滑肌细胞中基质细胞衍生因子1α mRNA表达开始增加,至损伤第7天后逐渐减弱;血管损伤后4 d起,骨髓基质细胞中CXCR4 mRNA开始出现,并持续表达;transwell小室显示损伤后的骨髓基质细胞对基质细胞衍生因子1α的趋化性增强;CXCR4受体拮抗剂AMD3100可以明显减弱基质细胞衍生因子1α对骨髓基质细胞的趋化作用;损伤后的血管平滑肌细胞对骨髓基质细胞的趋化作用强于基质细胞衍生因子1α(P < 0.05),应用AMD3100干预或细胞内转染基质细胞衍生因子1α siRNA后,此趋化作用亦减弱(P < 0.05)。结果提示,基质细胞衍生因子1α/CXCR4轴在骨髓基质细胞向损伤血管迁移中起重要的作用。     

骨髓单个核细胞移植对心肌基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的影响

背景：心脏干细胞移植后心肌基质细胞衍生因子1-CXCR4轴表达及其作用越来越受到人们的关注。 目的：观察经心外膜注骨髓单个核细胞对心衰犬心脏基质细胞衍生因子1-CXCR4轴 mRNA表达的影响。 方法：16只杂种犬随机数字表法均分为移植组和对照组,植入永久起搏器。右室快速起搏三四周后建立心衰模型。移植组犬经心外膜多点注射骨髓单个核细胞悬液,对照组注射等量生理盐水。 结果与结论：快速起搏三四周后,各项超声参数及血流动力学参数较起搏前改变明显,差异有显著性意义。定量PCR检测细胞移植组基质细胞衍生因子1 mRNA及CXCR4 mRNA表达水平高于对照组(P < 0.01)。说明经心外膜注射的骨髓单个核细胞可提高心肌基质细胞衍生因子1 mRNA及CXCR4 mRNA表达水平。     

骨髓和脂肪来源间充质干细胞的免疫调节作用☆

背景：脂肪来源的间充质干细胞是否具有和骨髓来源间充质干细胞类似的免疫调节作用?目的：观察骨髓来源和脂肪来源间充质干细胞的免疫学特征。方法：分离骨髓和脂肪来源的间充质干细胞,分别检测它们对T细胞周期、活化、抑制和增殖的作用情况。结果与结论：骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞同样具有抑制T细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T细胞增殖中这种作用都是具有剂量依赖性的,在1︰2时有极强的抑制作用,但是在1︰100时这种作用基本消失,在共培养时骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞都可以使更多的T细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T细胞的早期活化,但是上述作用脂肪来源的间充质干细胞均较骨髓来源间充质干细胞弱,且脂肪来源的间充质干细胞并不具有抑制T细胞凋亡的作用。     

体外条件下人骨髓间充质干细胞与NZBW F1鼠T淋巴细胞的免疫调节

背景：近年研究发现系统性红斑狼疮患者的间充质干细胞存在异常,自体造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮复发率高,有学者提出系统性红斑狼疮不仅是造血干细胞病,也是间质干细胞病。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞在体外对NZBW F1鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用。 设计、时间及地点：细胞共培养体外实验,于2008-03/09在江苏大学附属医院中心实验室完成。 材料：健康人骨髓由江苏大学附属医院研究生自愿捐献。SPF级20周龄NZBW F1雌鼠9只,购自南京大学动物模式研究所。 方法：Percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,取P3代细胞用于实验。20周龄NZBW F1小鼠适应性饲养至24周龄时,无菌分离脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A刺激下,将T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞分别以不同比例(1∶0.01,1∶0.02,1∶0.1)共培养72 h,并设立对照组。 主要观察指标：MTT法检测T淋巴细胞增殖,流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡和CD69,CD28表达,实时荧光定量PCR检测T淋巴细胞白细胞介素10、干扰素γ mRNA水平。 结果：与对照组比较,在体外人骨髓间充质干细胞能抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P < 0.05)。与对照组比较,T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.02和1∶0.1时,骨髓间充质干细胞可抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进T淋巴细胞干扰素γ mRNA表达,抑制白细胞介素10 mRNA表达;T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.01时,T淋巴细胞凋亡情况和干扰素γ、白细胞介素10 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：人骨髓间充质干细胞体外在一定比例下可能通过抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖和凋亡、干预Th1/Th2细胞因子mRNA表达,继而下调T淋巴细胞的免疫功能。     

银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平

背景：课题组在前期研究中发现银屑病患者骨髓造血细胞活性存在异常。 目的：观察银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。 设计、时间及地点：病例-对照观察,于2007-10/2008-08在太原市中心医院皮肤科实验室完成。 对象：选择太原市中心医院皮肤科临床及病理确诊为寻常型银屑病的门诊患者24例,男16例,女8例;年龄16~59岁;另取血液科骨穿后经筛选的正常骨髓20例作为对照组,性别、年龄与银屑病患者匹配。 方法：采用密度梯度离心法分离银屑病患者与对照组骨髓单一核细胞,通过贴壁法培养骨髓基质细胞,收集传了3代后又培养72 h的骨髓基质细胞及培养上清。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞表面标志并用ELISA法检测上清液中干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。 结果：流式细胞仪检测结果显示,90%以上细胞表面抗原高表达CD29,而CD34、CD45及HLA-DR表达阴性,即骨髓基质细胞纯度在90%以上。银屑病组骨髓基质细胞培养上清液的干细胞因子和粒细胞集落刺激因子表达均显著高于对照组 (P < 0.01)。 结论：银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子存在异常,提示银屑病患者骨髓造血微环境发生了改变。     

骨髓间充质干细胞抑制再生障碍性贫血患者外周血T细胞增殖的实验研究

背景：既往研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,而再生障碍性贫血患者存在T淋巴细胞异常活化及增殖。 目的：体外分析骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞增殖的抑制作用。 方法：分离再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞,行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA SE)荧光染色,与体外培养扩增的骨髓间充质干细胞按3︰1比例直接接触法及Transwell法共培养,加入植物血凝素(PHA)刺激T淋巴细胞增殖,并设阴性及阳性对照。流式细胞术检测各组T细胞增殖情况,评价骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响。 结果与结论：CFDA SE染色分析显示,直接接触组T细胞增殖较阳性对照组明显减低(P < 0.01);Transwell组T细胞增殖亦较阳性对照组减低(P < 0.05);直接接触组T细胞增殖较Transwell组明显减低(P < 0.01)。骨髓间充质干细胞可能通过直接接触及分泌某些细胞因子方式抑制再生障碍性贫血患者异常增殖的T细胞,以直接接触方式发挥主要作用。     

骨髓间充质干细胞分泌的蛋白及其功能

摘要：骨髓间充质干细胞的主要功能是支持和营养造血细胞,其提供的微环境由其分泌的可溶性物质、细胞表面分子以及细胞外基质组成,这三者中研究较多并且更有现实意义的是骨髓间充质干细胞分泌的可溶性物质。骨髓间充质干细胞除了可以分泌一些造血功能必须的细胞因子,如白细胞介素6、白细胞介素7、白细胞介素8、白细胞介素11、白细胞介素12、白细胞介素14、白细胞介素15、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和干细胞因子,长期支持造血干细胞的造血功能。还可以分泌许多神经营养因子,如脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子、神经生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子、肝细胞生长因子和血小板衍生的生长因子等,这些因子可以参与中枢神经系统的神经再生,促进损伤脑组织的生存与重塑。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞的生物学特性及其造血调控

由于慢性粒细胞白血病存在造血微环境异常和免疫异常,推测间充质干细胞可能在慢性粒细胞白血病的病理过程中扮演了一个重要角色。 目的：观察慢性粒细胞白血病骨髓间充质干细胞的生物学特征和对造血调控的影响,比较其与正常人骨髓来源的间充质干细胞的异常。 方法：分离正常人和慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞,分别检测它们的形态、表型、生长曲线和对T细胞活化的能力;将它们分别与脐带血干细胞共培养,检测共培养体系中对集落形成的影响和相关分子表达的差异。 结果与结论：慢性粒细胞白血病患者和正常志愿者骨髓来源的间充质干细胞的细胞形态、表型和干细胞的倍增时间均没有差异,慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞抑制T细胞活化的能力减弱;共培养体系中,悬浮细胞簇增加,说明造血干细胞与间充质干细胞之间的黏附性减弱,同时蛋白和RNA水平显示慢粒组中基质金属蛋白酶9升高,同时使ICAM-1的KitL从膜形式转变为可溶性形式。结果提示,慢性粒细胞白血病骨髓间充质干细胞是细胞分化发育的微环境,其基础的机制在于基质金属蛋白酶9对细胞外基质的降解和黏附分子的裂解,改变骨髓微环境对造血干细胞黏附,增殖和分化的支持作用,导致造血干细胞异常增殖和动员,降低了恶变细胞对免疫细胞的敏感性导致免疫逃逸。     

辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖分化的影响**

背景：辛伐他汀对正常大鼠骨代谢及骨髓基质干细胞增殖分化影响的报道目前不多。 目的：观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响,及其在此过程中Smad1,2,7 mRNA表达水平的变化。 方法：16只6周龄雌性SD大鼠按体质量随机均分成2组,对照组每天灌胃蒸馏水,实验组灌胃辛伐他汀20 mg/(kg•d),持续9周。于最后一次灌胃的第2天取左侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取右侧股骨和胫骨骨髓基质细胞向成骨方向诱导培养,并采用CCK-8法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16,28天检测碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比;细胞培养第21天,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测Smad1,2,7的mRNA表达。 结果与结论：辛伐他汀体内给药干预9周后,大鼠骨量和骨密度无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、细胞增殖能力、细胞外基质矿化能力、碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比两组间差异均无显著性意义 (P > 0.05)。结果显示20 mg/(kg•d)辛伐他汀体内给药9周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化及Smad1,2,7的表达无显著作用。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及化疗敏感性的影响

背景：近年来研究发现，骨髓造血微环境尤其是骨髓间充质干细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。 目的：探讨联合正常人骨髓间充质干细胞共培养后，K562细胞的增殖情况及对化疗敏感性的变化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-06/2008-06在南京医科大学附属南京儿童医院完成。 材料：骨髓来源于南京医科大学附属南京儿童医院骨科收治的下肢骨折需手术的患儿。 方法：percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞。设立2组：单独培养组培养皿中只接种处于对数生长期的K562细胞1×106个；共培养组培养皿中按2×108 L-1接种第3代人骨髓间充质干细胞，3 d后全量换液，再加入处于对数生长期的K562细胞1×106个，共培养24 h。消化收集两组K562细胞，分别加入质量浓度为0.1，0.2，0.4，0.8 mg/L的阿糖胞苷，再次培养24 h。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞对K562细胞生长曲线、细胞周期的影响。不同质量浓度阿糖胞苷干预后K562细胞凋亡率的变化。 结果：与单独培养组比较，共培养组K562细胞数明显降低，至第7天仅为单独培养组的57.7%；G0/G1期、G2期共培养组K562细胞比例明显增加（P均< 0.05），S期、S+G2期共培养组K562细胞比例显著减少（P < 0.01，P < 0.05）。阿糖胞苷质量浓度为0.1~0.8 mg/L时，对K562细胞诱发凋亡作用逐渐增强；在相同质量浓度的阿糖胞苷干预下，共培养组K562细胞凋亡率明显低于单独培养组（P < 0.05）。 结论：与骨髓间充质干细胞共培养后，K562细胞的生长受到抑制，且处于增殖期的细胞比例下降，主要阻滞于G0/G1期。骨髓间充质干细胞对K562细胞具有保护作用，可降低阿糖胞苷诱导K562细胞的凋亡率，产生化疗耐药。     

人脂肪神经干细胞移植对大鼠脑缺血后血管新生和细胞因子的作用

背景：近年来研究发现，骨髓造血微环境尤其是骨髓间充质干细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。 目的：探讨联合正常人骨髓间充质干细胞共培养后，K562细胞的增殖情况及对化疗敏感性的变化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-06/2008-06在南京医科大学附属南京儿童医院完成。 材料：骨髓来源于南京医科大学附属南京儿童医院骨科收治的下肢骨折需手术的患儿。 方法：percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞。设立2组：单独培养组培养皿中只接种处于对数生长期的K562细胞1×106个；共培养组培养皿中按2×108 L-1接种第3代人骨髓间充质干细胞，3 d后全量换液，再加入处于对数生长期的K562细胞1×106个，共培养24 h。消化收集两组K562细胞，分别加入质量浓度为0.1，0.2，0.4，0.8 mg/L的阿糖胞苷，再次培养24 h。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞对K562细胞生长曲线、细胞周期的影响。不同质量浓度阿糖胞苷干预后K562细胞凋亡率的变化。 结果：与单独培养组比较，共培养组K562细胞数明显降低，至第7天仅为单独培养组的57.7%；G0/G1期、G2期共培养组K562细胞比例明显增加（P均< 0.05），S期、S+G2期共培养组K562细胞比例显著减少（P < 0.01，P < 0.05）。阿糖胞苷质量浓度为0.1~0.8 mg/L时，对K562细胞诱发凋亡作用逐渐增强；在相同质量浓度的阿糖胞苷干预下，共培养组K562细胞凋亡率明显低于单独培养组（P < 0.05）。 结论：与骨髓间充质干细胞共培养后，K562细胞的生长受到抑制，且处于增殖期的细胞比例下降，主要阻滞于G0/G1期。骨髓间充质干细胞对K562细胞具有保护作用，可降低阿糖胞苷诱导K562细胞的凋亡率，产生化疗耐药。     

骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化☆

目的：神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素，而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性。 方法：实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。①动物：2~4周龄清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠颈脱臼法处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，去除两端骨骺，暴露骨髓腔，用DMEM培养液反复冲洗，收集冲洗液，重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中，培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化。取培养至第4代的骨髓间充质干细胞，加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化。③实验评估：观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色，检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率。 结果：①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化：经诱导分化后，大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征，胞质向细胞核回缩，细胞突起向外延伸，折光性增强，随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达：细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率：在诱导分化条件下，半乳糖脑苷脂阳性率为65%，磷脂碱性蛋白阳性率为45%，微管相关蛋白2阳性率为10%。 结论：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用，能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对T细胞增殖的抑制

背景：研究表明骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞的增殖活化,发挥负性免疫调节作用。 目的：利用全反式维甲酸体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,并探讨分化细胞对T细胞增殖的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03在广东医学院完成。 材料：4周龄雄性SD大鼠2只,由广东医学院动物中心提供。新鲜健康人血由广东医学院检验科提供。 方法：通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外传代扩增。取传至5代的骨髓间充质干细胞,加入含0.3 mg/L全反式维甲酸、体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM液进行预诱导,24 h后吸去预诱导液,加入含0.6 mg/L全反式维甲酸的LG-DMEM液向神经元样细胞诱导分化。取新鲜健康人血制备反应细胞,大鼠骨髓间充质干细胞作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞反应实验,设立4组：对照组,单纯反应细胞100 μL,细胞浓度1×109 L-1;实验1组：1×104神经元样细胞+100 μL反应细胞;实验2组：1×105神经元样细胞+100 μL反应细胞;实验3组：1×106神经元样细胞+100 μL反应细胞。 主要观察指标：诱导分化后细胞形态变化及神经细胞鉴定,单向混合淋巴细胞反应结果。 结果：加入诱导液50 min后,光镜下骨髓间充质干细胞呈典型的核周体形态,3 h后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,出现胞体和突起。免疫细胞化学染色结果显示,大部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶及巢蛋白阳性表达,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达。与对照组比较,各实验组放射性核素每分钟闪烁数值均明显减少(P < 0.05),且各实验组间比较差异亦有显著性意义(P < 0.05),随着加入细胞数量的增多,抑制作用越明显。 结论：全反式维甲酸可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,分化后的神经元样细胞能够抑制人淋巴细胞增殖,并呈剂量依赖性增加。