骨保护素的研究进展

骨保护素是一种新发现的分泌型糖蛋白和缺乏跨膜结构域的肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要通过与骨保护素配体结合而起作用。骨保护素不仅抑制破骨细胞生成，还抑制破骨细胞的骨吸收功能。骨保护素转基因(骨保护素^ / )致过量表达骨保护素的小鼠呈现骨硬化症表型；而骨保护紊基因敲除(骨保护素^ / )致骨保护紊缺乏小鼠在成熟前即显示严重骨质疏松及主动脉和肾动脉钙化。用重组骨保护素治疗可预防骨质疏松和血管钙化及逆转骨质疏松，骨保护素与代谢骨病和血管钙化之间的关系正日益引起重视。     

透析患者血管钙化的机制及进展

血管钙化是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在精密调控下,主动转分化为成骨样细胞的过程。高血磷能诱导VSMC向成骨样细胞转分化。高磷血症也会增加成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor 23,FGF23)水平,FGF23与Klotho一起是血管钙化的致病因素。高水平的FGF23与血管钙化有关,慢性肾衰竭患者肾组织Klotho的基因和蛋白表达水平显著下降。尿毒症动物模型中补充重组骨保护素(osteoprotegerin,OPG)能够明显减轻低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)受体缺乏小鼠的血管钙化,提高核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)可以介导血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠的血管钙化。氧化应激对血管钙化的影响可能与产生一些过氧化产物和抗氧化应激能力降低有关。高转换骨病是尿毒症患者最常见的骨病类型,高水平的甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)促进骨重构,加强破骨细胞的形成,激活骨吸收。尿毒症患者血清中的钙化抑制因子如胎球蛋白A和焦磷酸盐降低,促进了血管钙化。     

不同剂量骨保护素对破骨细胞内一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶的影响

背景：骨保护素和一氧化氮在防治骨质疏松方面有重要作用,但目前关于两者在抑制破骨细胞增殖分化方面的关系研究较少。
　　目的：验证不同剂量的骨保护素对破骨细胞内生成一氧化氮量及内皮型一氧化氮合酶活性的影响。
　　方法：用抗酒石酸酸性磷酸酶染色验证诱导生成的破骨细胞;将诱导生成的破骨细胞分成6个组,空白对照组不加任何试剂;阴性对照组培养液中加入培养液;骨保护素组分为4组分别加入10,25,50,75μg/L不同剂量的骨保护素试剂。采用Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒,利用流式细胞仪测定破骨细胞凋亡率;荧光定量PCR检测破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA及蛋白激酶K mRNA 的表达量变化;一氧化氮检测试剂盒检测破骨细胞中内一氧化氮浓度;内皮型一氧化氮合成酶活力试剂盒检测破骨细胞内一氧化氮合酶的活力;骨保护素各组加入内皮细胞型一氧化氮合酶抑制剂;荧光定量PCR检测破骨细胞特异性酶抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA及蛋白激酶K mRNA表达量的变化。
　　结果与结论：①骨保护素可以抑制破骨细胞的分化生成并诱导其凋亡。②骨保护素的质量浓度与诱导生成的破骨细胞数量及其标志酶mRNA的表达量呈负相关,与破骨细胞凋亡率呈正相关。③骨保护素可以增加破骨细胞内一氧化氮的生成以及内皮型一氧化氮合酶活性的升高;骨保护素的质量浓度与破骨细胞生成的一氧化氮浓度及内皮型一氧化氮合酶活性呈正相关。④Raw264.7细胞在体外培养条件下,骨保护素与一氧化氮在抑制破骨细胞生成及促进其凋亡方面有协同作用,推测两者之间可能存在骨保护素/内皮型一氧化氮合酶/一氧化氮信号通路。     

联合应用骨保护素和阿伦膦酸钠对破骨前体细胞分化的影响

目的:探讨联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠对破骨细胞前体细胞(RAW264.7)分化的抑制效果,并探讨二者是否具有抑制破骨细胞前体细胞(RAW264.7)分化的协同作用。方法:实验于2004-06/12在解放军总医院骨科研究所完成。酶消化法获取新生小鼠颅骨成骨细胞,与破骨细胞前体细胞(RAW264.7)按照4:1比例混合,培养于96孔板中和6孔板骨磨片体系中。分别使用1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断、10mol/L阿伦膦酸钠、1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断+10mol/L阿伦膦酸钠作用于96孔板和6孔板混合细胞体系,并设空白对照。9d后,观察破骨细胞数目和形态,计算单位面积内重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数,并行骨磨片吸收陷窝计数。统计学分析评价其抑制破骨细胞分化效果。结果:①破骨细胞常规形态及重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞计数:小鼠成骨细胞与RAW264.7混合培养并加入药物后9d,空白对照组出现大量多核成熟破骨细胞,重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色证实为成熟破骨细胞。②骨磨片吸收陷窝形态及计数:与空白对照组相比,其余各组破骨细胞重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数,骨磨片吸收陷窝计数均明显减少,以1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断+10mol/L阿伦膦酸钠组减少最为显著。③重组人骨保护素活性片断组与阿伦膦酸钠组析因设计的方差分析:加药后9d重组人骨保护素活性片断与阿伦膦酸钠存在交互作用(F=19.878,623.57;P<0.05)。结论:联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠可以发挥交互协同作用,更有效地抑制RAW264.7向成熟破骨细胞的分化。     

骨保护素抑制肿瘤坏死因子诱导的成骨细胞凋亡

背景骨质疏松涉及破骨细胞分化成熟和成骨类细胞凋亡两方面,肿瘤坏死因子α能诱导多种细胞凋亡且效率差异很大,骨保护素能抑制破骨细胞成熟,但对成骨类细胞凋亡的作用未见报道.目的探讨肿瘤坏死因子α能否诱导成骨类细胞凋亡及骨保护素能否抑制其凋亡.设计以成骨细胞和MG63细胞作为实验对象、以鼠WEHI 164细胞系用于阳性对照的观察对比分析.单位解放军总医院全军口腔医学研究所、美国匹茨堡医学院退伍军人医疗中心.材料本实验于2001-01/2003-12在Dr.Blair实验室和口腔研究所实验室完成.选择商品化细胞系,RPMI 1640培养液和各种相关蛋白用于实验.方法用人间充质干细胞在分化培养液中培养21 d使之成为成骨细胞,与MG63一起用于凋亡实验.Annexin V和原位末端标记法检测肿瘤坏死因子α诱导成骨类细胞凋亡.主要观察指标全部细胞数及凋亡细胞数.结果和FasL诱导细胞凋亡一样,肿瘤坏死因子α能引起MG63骨肉瘤细胞,间充质干细胞和成骨细胞的凋亡,并表现为明显的浓度依赖和时间依赖.低浓度肿瘤坏死因子α(170～500 pmol/L)作用于细胞2～4 h就显示了较明显的凋亡,而骨保护素在0.45～1.5 nmol/L浓度时,几乎完全抑制了500 pmol/L肿瘤坏死因子α诱导的凋亡.成骨细胞分泌骨保护素,而破骨细胞及破骨前体细胞产生肿瘤坏死因子α,它们相互作用降低成骨细胞的凋亡.结论肿瘤坏死因子α能诱导成骨类细胞凋亡,骨保护素能够抑制肿瘤坏死因子α的凋亡诱导作用,从抑制破骨细胞成熟和成骨细胞凋亡两方面表现骨保护素防治骨质疏松的作用机制.     

联合应用骨保护素和阿伦膦酸钠对破骨前体细胞分化的影响

目的：探讨联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠对破骨细胞前体细胞（RAW264.7）分化的抑制效果，并探讨二者是否具有抑制破骨细胞前体细胞（RAW264.7）分化的协同作用。方法：实验于2004-06／12在解放军总医院骨科研究所完成。酶消化法获取新生小鼠颅骨成骨细胞，与破骨细胞前体细胞（RAW264.7）按照4：1比例混合，培养于96孔板中和6孔板骨磨片体系中。分别使用1&;#215;10^-5g／L重组人骨保护素活性片断、10mol／L阿伦膦酸钠、1&;#215;10^-5g/L重组人骨保护素活性片断＋10mol／L阿伦膦酸钠作用于96孔板和6孔板混合细胞体系，并设空白对照。9d后，观察破骨细胞数目和形态，计算单位面积内重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数，并行骨磨片吸收陷窝计数。统计学分析评价其抑制破骨细胞分化效果。结果：①破骨细胞常规形态及重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞计数：小鼠成骨细胞与RAW264．7混合培养并加入药物后9d，空白列照组出现大量多核成熟破骨细胞，重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色证实为成熟破骨细胞。②骨磨片吸收陷窝形态及计数：与空白对照组相比，其余各组破骨细胞重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数，骨磨片吸收陷窝计数均明显减少，以1&;#215;^-5g／L重组人骨保护索糟性片断＋10mol/L阿伦膦酸钠组减少最为显著。③重组人骨保护素活性片断组与阿伦膦酸钠组析因设计的方差分析：加药后9d重组人骨保护素活性片断与阿伦膦酸钠存在交互作用（F=19．878，623．57；P〈0．05）。结论：联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠可以发挥交互协同作用，更有效地抑制RAW264．7向成熟破骨细胞的分化。     

骨保护素抑制肿瘤坏死因子诱导的成骨细胞凋亡

背景：骨质疏松涉及破骨细胞分化成熟和成骨类细胞凋亡两方面，肿瘤坏死因子α能诱导多种细胞凋亡且效率差异很大，骨保护素能抑制破骨细胞成熟，但对成骨类细胞凋亡的作用未见报道。目的：探讨肿瘤坏死因子α能否诱导成骨类细胞凋亡及骨保护素能否抑制其凋亡。设计：以成骨细胞和MG63细胞作为实验对象、以鼠WEHI164细胞系用于阳性对照的观察对比分析。单位：解放军总医院全军口腔医学研究所、美国匹茨堡医学院退伍军人医疗中心。材料：本实验于2001-01／2003—12在Dr．Blair实验室和口腔研究所实验室完成。选择商品化细胞系，RPMI1640培养液和各种相关蛋白用于实验。方法：用人间充质干细胞在分化培养液中培养21d使之成为成骨细胞，与MG63一起用于凋亡实验。AnnexinV和原位末端标记法检测肿瘤坏死因子α诱导成骨类细胞凋亡。主要观察指标：全部细胞数及凋亡细胞数。结果：和FasL诱导细胞凋亡一样，肿瘤坏死因子α能引起MG63骨肉瘤细胞，间充质干细胞和成骨细胞的凋亡，并表现为明显的浓度依赖和时间依赖。低浓度肿瘤坏死因子α(170～500pmol／L)作用于细胞2～4h就显示了较明显的凋亡，而骨保护素在0.45～1.5nmol／L浓度时，几乎完全抑制了500pmol／L肿瘤坏死因子α诱导的凋亡。成骨细胞分泌骨保护素，而破骨细胞及破骨前体细胞产生肿瘤坏死因子α，它们相互作用降低成骨细胞的凋亡。结论：肿瘤坏死因子α能诱导成骨类细胞凋亡，骨保护素能够抑制肿瘤坏死因子α的凋亡诱导作用，从抑制破骨细胞成熟和成骨细胞凋亡两方面表现骨保护素防治骨质疏松的作用机制。     

人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定

目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆入骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性.方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成.采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒.以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护索-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性.结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白.②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带.③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合.④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性.⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性.结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性.     

血液透析患者血清护骨素、胎球蛋白A与心血管病变关系的研究进展

心血管疾病发病率和死亡率在血液透析患者中仍然很高,其发生与过多的骨钙化在血管调节中的变化相关,护骨素作为肿瘤坏死因子受体超家族的一员,具有抗破骨细胞作用,是一个重要的血管钙化调节因子。在血液透析患者中,高水平的护骨素与血管钙化及心血管疾病的病死率密切相关。胎球蛋白A是磷酸钙的一种有效的系统性抑制剂,可防止钙磷沉积,在血液透析患者中,其水平和普遍性与严重的血管钙化相关。护骨素及胎球蛋白A可作为标记物,在长期血液透析患者中，与其全因死亡率和心血管疾病死亡率相关。     

脂联素对成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体表达的影响

背景:在骨组织中,护骨素的主要作用是抑制破骨细胞的形成和活性,核转录因子κB受体活化素配体的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性,抑制破骨细胞的凋亡.护骨素/核转录因子κB受体活化素配体在破骨功能调控中起重要作用.近来研究发现脂联素促进成骨细胞增殖和分化,脂联素与骨代谢相互偶联.但脂联素对破骨细胞的作用不明.目的:观察脂联素对成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体和护骨素表达的影响,进一步分析其对破骨细胞生成的作用.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-0612008-12在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成.材料:外科手术取正常成人髂前上棘松质骨用于细胞培养,临床标本由湘雅医院提供.方法:分别用0,3,10和30 mg/L脂联素干预人成骨细胞48 h,检测护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.并用脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统,观察其对破骨细胞生成的影响.主要观察指标:分别采用荧光定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附法检测人成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.抗酒石酸磷酸酶染色确定为破骨细胞.结果:脂联素呈剂量依赖性抑制人成骨细胞护骨素mRNA与蛋白质的表达(P<0.05).脂联素呈剂量依赖性促进人成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白的表达(P<0.05).脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成.结论:脂联素可通过诱导成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体表达、抑制护骨素表达,诱导破骨细胞生成.