重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。     

腺相关病毒载体及其在血友病A基因治疗中的应用

腺相关病毒(AAV)载体所具有的生物学特性,使其成为一些需要目的基因长期而稳定表达的疾病基因治疗的理想载体之一。BDD F Ⅷ cDNA的应用以及AAV包装容量的拓展,可能使AAV在血友病A的基因治疗中发挥重要作用。     

组织工程研究中病毒表达载体的构建

组织工程中的表达载体按构建来源类型可分为质粒和病毒表达载体。其中病毒表达载体包括腺病毒、反转录病毒和慢病毒表达载体。腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒,基因组内有14个基因。反转录病毒是使最常用的一种病毒载体,是由具有感染性的小白鼠白血病病毒改造而来。慢病毒表达载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。     

骨关节炎软骨中衰老相关β-半乳糖苷酶和c-Fos蛋白的表达

背景：文献在对软骨细胞衰老的研究中,常以衰老相关β-半乳糖苷酶的表达作为其细胞老化的一个指标,而c-Fos在骨关节炎软骨中表达情况罕见报道。目的：观察β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白在正常关节软骨和骨关节炎不同退变程度关节软骨中表达水平的差异。方法：选取正常关节软骨标本10个,骨关节炎软骨标本26个,根据大体观察凿取正常和骨关节炎不同退变严重程度软骨块50个,再根据关节软骨改良Mankin病理评分法分为正常关节软骨组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组。采用免疫组织化学SABC法,计算各组标本中软骨细胞β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白染色阳性细胞率,比较各组中二者阳性细胞率的差异性并分析其与关节软骨不同退变程度之间的相关性。结果与结论：随着衰老软骨细胞阳性率逐渐增加,软骨退变程度逐渐加重,提示软骨细胞衰老与骨关节炎病程进展有关,软骨细胞衰老是骨关节炎可能的发病机制之一。c-Fos蛋白与骨关节炎软骨退变严重程度和软骨细胞衰老均无直接相关性,但可能在软骨退变早中期促进软骨细胞代偿性分裂增殖活跃。     

本期专题：组织工程研究中病毒表达载体的构建①

1构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定,见2010年37期6908。2新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测．见2010年7期1227。     

骨关节炎软骨中衰老相关β-半乳糖苷酶和c-Fos蛋白的表达

背景:文献在对软骨细胞衰老的研究中,常以衰老相关β-半乳糖苷酶的表达作为其细胞老化的一个指标,而c-Fos在骨关节炎软骨中表达情况罕见报道.目的:观察β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白在正常关节软骨和骨关节炎不同退变程度关节软骨中表达水平的差异.方法:选取正常关节软骨标本10个,骨关节炎软骨标本26个,根据大体观察凿取正常和骨关节炎不同退变严重程度软骨块50个,再根据关节软骨改良Mankin病理评分法分为正常关节软骨组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组.采用免疫组织化学SABC法,计算各组标本中软骨细胞β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白染色阳性细胞率,比较各组中二者阳性细胞率的差异性并分析其与关节软骨不同退变程度之间的相关性.结果与结论:随着衰老软骨细胞阳性率逐渐增加,软骨退变程度逐渐加重,提示软骨细胞衰老与骨关节炎病程进展有关,软骨细胞衰老是骨关节炎可能的发病机制之一.c-Fos蛋白与骨关节炎软骨退变严重程度和软骨细胞衰老均无直接相关性,但可能在软骨退变早中期促进软骨细胞代偿性分裂增殖活跃.     

CRTER杂志组织构建栏目关于“反转录腺病毒载体构建”研究的组稿内容

○新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测○反转录病毒载体介导转化生长因子β1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达○Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其     

胰腺炎大鼠腹腔积液中硫氧还蛋白表达与腹膜功能衰竭的关联机制

目的 探讨胰腺炎大鼠腹腔积液中硫氧还蛋白表达与腹膜功能衰竭的关联机制.方法 60只SD大鼠按照随机数字表法分为2组:对照组(n=30,不做任何干预)和实验组(n=30,通过注射牛磺胆酸钠构建大鼠急性胰腺炎模型).模型建立成功后次日,将每组大鼠分为2批,分别采用N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)和硫乙醇酸盐腹...     

CRTER杂志“软组织工程”栏目关于“载体构建”的组稿内容

○重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建 ○髓磷脂相关抑制物小分子干扰真核表达载体构建 ○携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建     

报告基因系统的研究进展

综述氯霉素转乙酰酶 (CAT)、β 半乳糖苷酶 (β gal)、β 葡萄糖苷酸酶 (p GUS)、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)、荧光素酶(luc)、绿荧光蛋白 (GFP)等报告基因系统研究与应用进展 ;简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。     

本期专题：干细胞与转基因技术

1绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验 2Ad-GFP修饰的间充质干细胞在肺气肿大鼠体内向肺部的定向迁移 3体外转染绿色荧光蛋白基因的肌源性干细胞移植修复大鼠脊髓损伤     

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉:最佳在体表达时间点的确定

背景:重组9型腺相关病毒载体对心肌组织具有较高的亲和力,关于携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein,r AAV9-e GFP)在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉中的表达情况还不确定。目的:探索携带r AAV9-e GFP转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉最佳的在体表达时间点。方法:给予30只Apo E-/-小鼠连续高脂饮食饲养16周建立为动脉粥样硬化模型,然后随机取其中25只通过尾静脉注射转染5.0×1011 vg(virus genomes)r AAV9-e GFP,另5只作为对照组给予生理盐水。转染病毒的动脉粥样硬化模型小鼠分别于转染后14,21,28,35,60 d处死,留取主动脉组织,应用激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白荧光表达情况,Western blot法检测主动脉增强型绿色荧光蛋白的蛋白表达,观察增强型绿色荧光蛋白体内表达情况,确定病毒在体表达最佳时间点。结果与结论:r AAV9-e GFP可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管,增强型绿色荧光蛋白可在主动脉组织中表达,其表达强度随着转染时间的增加而逐渐增强,于转染35 d时表达最强,60 d趋于稳定,各时间点主动脉斑块中增强型绿色荧光蛋白表达的水平差异有显著意义(P<0.001)。表明r AAV9-e GFP可有效在动脉粥样硬化模型Apo E-/-小鼠主动脉中表达,r AAV9-e GFP可成为动脉粥样硬化治疗的最佳载体。     

重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.