凝胶包埋兔脂肪基质细胞接种三维支架动态构建组织工程化骨

目的 探讨高效的细胞种植方法,提高工程化骨构建质量.方法 成骨诱导化脂肪基质细胞,制备含rhBMP-2的纳米化壳聚糖/胶原蛋白/β磷酸三钙(Cs-Col-β-TCP)支架,构建工程化骨.静态种植静态培养(A组),振荡种植静态培养(B组),凝胶+振荡种植静态培养(c组),凝胶+静态种植静态培养(D组).第1、4、 8、 12、16、20、24、28天,扫描电镜、共聚焦显微镜观察,检测细胞存活率、细胞增殖、碱性磷酸酶、DNA、骨钙素水平.结果 C组细胞分布均匀、呈三维内生长、细胞外基质丰富,细胞存活率、增殖活力、碱性磷酸酶、DNA、骨钙素水平均高于其他组(79.53±2.67、0.59±0.20、65.16±6.85、207.62±19.36、55.22±8.51,P<0.05).结论 凝胶联合振荡种植可提高细胞接种效率及增强诱导成骨活性.     

凝胶包埋脂肪基质细胞接受振荡载荷模式构筑工程化软骨的研究

目的 观察构建工程化软骨生物学行为,评估扩增软骨种子细胞的方法.方法 软骨诱导化脂肪基质细胞(ADSCs),接种至nβ-TCP/Cs/PCL支架构建工程化软骨:A组(凝胶+振荡培养)、B组(凝胶+静态培养)、C组(振荡培养)、D组(静态培养);每组48块构建物,各阶段每组随机取6块,第1、4、8、12、16、20、24、28天,电镜、共聚焦观察,检测存活率、细胞增殖、Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、DNA及氨基葡聚糖(GAG)含量.结果 A组细胞生长旺盛、细胞外基质丰富,存活率高于其他组(86.39±5.05,P<0.05),增殖活力、Col-Ⅱ、DNA及GAG含量均高于其他组(0.57±0.12,71.30±2.51,73.21±1.38,81.25±1.29,P<0.05).结论 凝胶包埋及振荡方式能扩增种子细胞及优化软骨构建质量.     

Ⅰ型胶原在PLGA-[ASP-PEG]表面修饰对兔骨髓基质干细胞生物力学的影响

目的探讨Ⅰ型胶原修饰聚乳酸-羟基乙酸/天冬氨酸-聚乙醇(PLGA-[ASP-PEG])支架材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)在其表面粘附、增殖及成骨分化的影响。方法采用化学方法将Ⅰ型胶原接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面,同时在材料表面物理涂层胶原溶液。将改性PLGA-[ASP-PEG]复合兔BMSCs培养,检测BMSCs粘附、增殖性能的变化及成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、核心结合因子al等的表达情况。结果X射线光电子能谱法证实Ⅰ型胶原成功接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。经化学接枝-物理涂层技术改性后PLGA-[ASP-PEG]膜表面的Ⅰ型胶原含量大大提高,明显高于经单纯化学接枝或单纯物理涂层技术改性后膜表面的胶原含量,且远高于二者之和。改性PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的粘附、增殖能力显著提高,其成骨标志物的表达均显著高于对照组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论Ⅰ型胶原能显著改善PLGA-[ASP-PEG]的细胞生物相容性,为组织工程支架材料的优化提供了一种新途径。     

转化生长因子-β基因转染骨髓基质干细胞在多肽修饰的聚乳酸-羟基乙酸上生长情况的研究

目的 探讨转转化生长因子-β(TGF-β)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)材料上的增殖、黏附、分化情况,以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用. 方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,把TGF-β基因转入BMSCs,以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照,分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上,培养1、2、3 d后,计数细胞密度以反映细胞增殖情况:接种后4、12 h,沉淀法定量检测黏附的细胞数;培养24 h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,观察细胞骨架的组织情况;用成骨性培养基培养7、14、21 d,检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性来了解BMSCs分化情况. 结果转TGF-β基因细胞密度显著增大,且在各时间点有较高的ALP活性.RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高,并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架,且在第14天时表现出高的ALP活性.结论 TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上,并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化.     

凝胶包埋BMP-2基因及振荡构建工程化骨的生物效应评估

目的 分析构建工程化骨的生物学行为,评估优化构筑工程化骨的方法. 方法 用人骨形态发生蛋白2腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染兔脂肪基质细胞,nB-TCP/Cs/PCL支架接种及构建工程化骨,分A组(基因转染加静态培养),B组(凝胶加生长因子加振荡培养)、C组(凝胶加基因转染加振荡培养)和D组(凝胶加生长因子加静态培养);第1、4、8、12、16、20、24、28天,电镜、共聚焦显微镜观察,检测凋亡率、增殖、碱性磷酸酶活性及体内成骨分析.结果 C组细胞生长旺盛,细胞外基质丰富,凋亡率低于其它组(P＜0.05),增殖活力、碱性磷酸酶水平均高于其它组(P＜0.05),工程化骨发育成熟. 结论 凝胶包埋成骨基因与振荡模式为构建工程化骨的理想方法.     

富血小板血浆对人脂肪来源干细胞增殖率的影响

目的:探讨不同比例富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)对人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的增殖及周期蛋白Cyclin D_1表达的影响。方法:分离培养ADSCs细胞,传代至第3代,流式细胞仪鉴定。全血中分离PRP。采用随机数字表法将将细胞分为4组(n=24):C组不做任何处理,PRP_(10)组、PRP_(20)组和PRP_(30)组在ADSCs中加入PRP使其容积比分别为10%、20%和30%,于37℃、5%CO_2培养箱中培养。应用MTT法检测各组细胞的增殖率,蛋白免疫印迹法(Western blot)测细胞周期蛋白Cyclin D_1的表达。结果:与C组比较,PRP_(10)组、PRP_(20)组、PRP_(30)组ADSCs细胞增殖率及Cyclin D_1蛋白的表达明显增高(P0.05);组间比较PRP30组ADSCs细胞增殖率及Cyclin D_1蛋白的表达高于PRP_(10)组和PRP_(20)组(P0.05)。结论:PRP以浓度依赖性方式促进ADSCs细胞内周期蛋白Cyclin D_1的表达,从而促进ADSCs的增殖。     

富血小板血浆与地塞米松对人骨髓基质干细胞成骨分化作用的对比研究

目的 通过系统评价富血小板血浆(PRP)与地塞米松(DEX)对人骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,为PRP临床骨组织修复应用提供更为可靠的实验依据.方法 将体外培养的BMSCs分为单纯血清培养组(FCS组)、PRP诱导组和DEX组,通过相差显微镜观察碱性磷酸酶(ALP)染色、钙盐沉积染色,RT-PCR法检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原(Coll-Ⅰ)、骨连接蛋白(ON)、中心结合因子(Cbfα1)mRNA表达系统评价PRP的成骨分化能力. 结果 PRP抑制了BMSCs向三角形、多角形细胞转变,DEX则诱导BMSCs向三角形、多角形细胞转变;PRP抑制了ALP分泌,钙盐沉积;DEX增加了ALP分泌,促进钙化结节形成.与FCS组相比,DEX促进了ALP、OCmRNA表达,PRP抑制了ALP、OC mRNA表达;PRP、DEX对Coll-Ⅰ、ON、Cbfα1 mRNA表达均无影响.结论 在本实验条件下,PRP对人BMSCs体外成骨分化的直接作用是抑制效应;在体外PRP并不能代替DEX作为人BMSCs成骨分化的诱导因子.     

高效抗逆转录病毒治疗对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的观察高效抗逆转录病毒药物血清干预骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的研究,探讨抗病毒药物对骨代谢的影响。方法采用3种HAART药物分别制备药物血清干预BMSC增殖及分化,CCK法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶、钙茜素及油红O染色观察细胞成骨、成脂分化,PCR检测BMSC向成骨分化过程中Runx 2和OPG基因表达水平。结果替诺福韦酯药物血清组与大鼠血清组比较,药物血清干预72 h时(A72 h)值差异具有统计学意义(F=15.42、P=0.004)。BMSC成骨诱导分化试验中,与对照组比较药物血清组干预组碱性磷酸酶染色阳性细胞减少,茜素红染色钙结节减少,其中替诺福韦酯药物血清组改变最为显著,而且成脂诱导分化中与对照组比较成脂样细胞增多。BMSC成骨诱导分化,PCR检测与对照组比较替诺福韦酯药物血清组Runx 2表达减少,OPG表达增加(F=11.81、P=0.026,F=10.14、P=0.033)。结论 HAART药物可能抑制BMSC增殖和成骨分化,其中替诺福韦酯的影响最为显著。     

人细胞外基质支架联合脂肪干细胞构建脂肪组织

目的 探讨人脂肪组织细胞外基质(ECM)支架联合人脂肪来源干细胞(ADSCs)构建工程化脂肪组织的可行性.方法 以酶消化法从人抽脂术抽吸物脂质部分获取人ADSCs,体外进行多向分化诱导鉴定,并行DiI荧光标记.从抽脂术的脂质部分分离提取人脂肪组织细胞外基质,经过低温冻干、粉碎、灭菌等处理,制备成粉末状,电镜扫描观察表面特征并将其与ADSCs进行黏附实验,探讨其作为支架材料的可行性.收集人ADSCs,以2×109/L的细胞密度与提取的细胞外基质支架复合后移植于裸鼠背部皮下,同鼠对侧背部皮下移植ECM支架和细胞培养液作为对照,每侧移植0.5 ml,共6只实验鼠.8周后取材,称量标本湿重.取出的标本行苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色进行定性判断,分析人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs构建工程化脂肪组织的能力.结果 从脂肪组织中分离得到人ADSCs和ECM支架.ADSCs在相应的诱导环境下能够分化成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞.ECM支架电镜扫描和大体观察具有疏松、多孔的结构特征,适合ADSCs的黏附生长.ADSCs与支架相容性良好,黏附率达(89.87±2.59)％,细胞在支架表面可充分伸展生长.体内移植8周后,实验组和对照组都能够形成新生物,湿重比较实验组较对照组重(P＜0.05).经HE切片及油红O染色均证实实验组形成成熟的脂肪组织,对照组不能形成脂肪组织.结论 人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs在体内能够成功构建成熟的脂肪组织,8周后支架并无明显吸收.     

自体PRP促进人脂肪来源干细胞成骨分化的体外实验研究

目的 探讨自体PRP对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 取自愿捐献吸脂术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs,倒置显微镜下观察细胞生长情况.将第3代ADSCs分别行成脂、成软骨定向诱导培养鉴定,并行CD29及CD44免疫荧光染色观察.取第3代ADSCs分别采用含10 mL/L PRP的成骨诱导培养基(PRP组)和不含PRP的成骨诱导培养基(对照组)进行培养,倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5 d采用MTT法检测细胞增殖活性;7、14、21、28 d行ALP活性检测,另取培养7、14 d的PRP组细胞行ALP染色观察;14 d时行PRP组茜素红染色检测钙结节形成情况.结果 倒置显微镜下第3代ADSCs多为梭形,倍增时间约35 h.成脂及成软骨诱导鉴定均为阳性,免疫荧光染色CD29和CD44呈阳性.MTT法示PRP组1、2、3、4、5 d的吸光度值分别为0.137±0.015、0.219±0.023、0.367±0.031、0.586±0.039、0.948±0.046,对照组分别为0.081±0.009、0.115±0.012、0.162±0.017、0.242±0.025、0.356±0.032,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导7 d后,PRP组ALP染色阳性,细胞胞浆呈灰黑色,可见黑色沉淀:14 d后阳性细胞增多.ALP活性检测示PRP组7、14、21、28 d细胞活性值分别为23.96±2.05、41.26±3.38、38.12±3.03、35.89±2.24,对照组分别为17.83±1.62、26.64±2.37、23.85±1.99、20.78±1.81,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导14 d后,茜索红染色示PRP组钙结节形成.结论 体外培养时,自体PRP可促进人ADSCs的增殖并诱导成骨分化,为骨组织工程提供一种新的种子细胞来源.     

纳米化仿生诱导骨的构建及促进兔横突间融合研究

目的 探讨纳米化仿生诱导骨促进兔脊柱融合的可行性.方法 成骨化兔脂肪基质细胞(ADSCs)接种在纳米级β磷酸三钙/壳聚糖/聚已内酯基质,构建纳米化仿生诱导骨;建立兔腰5～6横突间融合模型,A组纳米化仿生诱导骨,B组自体髂骨,C组脂肪基质细胞移植,D组空白支架,E组rhBMP-2注射.行影像学、组织学、免疫组化、新骨及诱导因子定量分析等检查.结果 A组融合能力最强,融合率100%、新骨面积比(87.32±1.68)%、BMP含量及力学指标(128±19)、(331.56±3.21)N、(526.78±3.19)Nmm均高于其他组,差异有统计学意义(P＜0.05);B、C组次之,E组新骨生长不明显,融合相对延缓.D组未融合.结论 仿生诱导骨能强化骨再生,促进脊柱融合.     

Autologous platelet-rich plasma induces bone formation of tissue-engineered bone with bone marrow mesenchymal stem cells on beta-tricalcium phosphate ceramics

Background

The purpose of the study is to investigate whether autologous platelet-rich plasma (PRP) can serve as bone-inducing factors to provide osteoinduction and improve bone regeneration for tissue-engineered bones fabricated with bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and beta-tricalcium phosphate (β-TCP) ceramics. The current study will give more insight into the contradictory osteogenic capacity of PRP.

Methods

The concentration of platelets, platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were measured in PRP and whole blood. Tissue-engineered bones using MSCs on β-TCP scaffolds in combination with autologous PRP were fabricated (PRP group). Controls were established without the use of autologous PRP (non-PRP group). In vitro, the proliferation and osteogenic differentiation of MSCs on fabricated constructs from six rabbits were evaluated with MTT assay, alkaline phosphatase (ALP) activity, and osteocalcin (OC) content measurement after 1, 7, and 14 days of culture. For in vivo study, the segmental defects of radial diaphyses of 12 rabbits from each group were repaired by fabricated constructs. Bone-forming capacity of the implanted constructs was determined by radiographic and histological analysis at 4 and 8 weeks postoperatively.

Results

PRP produced significantly higher concentration of platelets, PDGF-AB, and TGF-β1 than whole blood. In vitro study, MTT assay demonstrated that the MSCs in the presence of autologous PRP exhibited excellent proliferation at each time point. The results of osteogenic capacity detection showed significantly higher levels of synthesis of ALP and OC by the MSCs in combination with autologous PRP after 7 and 14 days of culture. In vivo study, radiographic observation showed that the PRP group produced significantly higher score than the non-PRP group at each time point. For histological evaluation, significantly higher volume of regenerated bone was found in the PRP group when compared with the non-PRP group at each time point.

Conclusions

Our study findings support the osteogenic capacity of autologous PRP. The results indicate that the use of autologous PRP is a simple and effective way to provide osteoinduction and improve bone regeneration for tissue-engineered bone reconstruction.

     

仿生诱导骨促进兔横突间脊柱融合的研究

目的 探讨仿生诱导骨促进兔脊柱融合的可行性.方法 成骨诱导化培养兔脂肪基质细胞、制备释放重组人骨形成发生蛋白(rhBMP)-2的壳聚糖/胶原蛋白/B磷酸三钙基质,联合生物凝胶+动态种植,构建仿生诱导骨;兔腰4～5横突间融合模型移植4组,A1仿生骨诱导骨;A2自体髂骨;B1 rhBMP-2的复合基质;B2空白支架.行组织学、免疫组织化学、新骨及诱导因子定量分析、手动触检,生物力学检查.结果 A1组骨性融合能力最强,融合率、新骨面积、BMP含量及力学指标均高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05);A2组次之,B1组新骨生长不明显,融合相对延缓.B2组未融合.结论 仿生诱导骨能强化骨诱导、传导效应,超越自体骨修复效果,促进脊柱融合.     

恒河猴间充质干细胞诱导分化成骨细胞复合6种支架材料的相容性研究

[目的]评价外消旋聚乳酸(poly-DL-lactide,PDLLA)、生物活性玻璃(bioactive glass,BG)、β-三磷酸钙(beta-tricalcium phosphate,β-TCP)与聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物[poly(lactic acid)-poly-ethylene glycol-poly(lactic acid)triblock copolymers,PLA-PEG-PLA]组合成的6种新型支架的细胞粘附性和细胞相容性,筛选出较好的细胞支架。[方法]选用恒河猴间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向分化为成骨细胞,采用体外细胞培养的方法,将细胞接种于PDLLA、PDLLA/BG、PDLLA/β-TCP、PDLLA/PLA-PEG-PLA、PDLLA/PLA-PEG-PLA/BG及PDLLA/PLA-PEG-PLA/β-TCP 6种可吸收性生物支架材料表面上,倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察恒河猴成骨细胞的粘附、增殖。[结果]倒置显微镜、SEM、ALP染色显示成骨细胞在PDLLA、PDLLA/PLA-PEG-PLA、PDLLA/β-TCP及PDLLA/BG 4种材料上能良好粘附、增殖,并向内部生长,而在PDLLA/PLA-PEG-PLA/BG、PDLLA/PLA-PEG-PLA/β-TCP两组材料上粘附差、细胞逐渐死亡;MTT法结果显示PDLLA/PLA-PEG-PLA、PDLLA/β-TCP及PDLLA/BG细胞活性优于单纯PDLLA支架,其中PDLLA/PLA-PEG-PLA最佳。[结论]PDLLA、PDLLA/PLA-PEG-PLA、PDLLA/BG及PDLLA/β-TCP4组材料能与成骨细胞良好粘附,具有良好的细胞相容性。     

双相生物钙磷陶瓷生物相容性及异位骨诱导的实验研究

目的检测运用羟基磷灰石及β-磷酸三钙制备的双相钙磷陶瓷的生物相容性及其异位骨诱导效率。方法采用化学共沉淀法及过氧化氢发泡法,将羟基磷灰石及β-磷酸三钙以6∶4的比例在1 100 ℃条件下烧结3 h获得双相钙磷陶瓷,利用X线衍射评估材料组成成分。分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,接种于双相钙磷陶瓷,通过扫描电镜、鬼笔环肽及DAPI染色观察细胞的黏附,CCK8法评估细胞增殖,碱性磷酸酶测定法评估骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达活性。将不含骨髓间充质干细胞的双相钙磷陶瓷置入比格犬竖脊肌内,于4、8、12周对样本行大体检测、组织染色,测算新骨生成率,从而评估双相钙磷陶瓷的异位骨诱导效率。结果成功制备双相钙磷陶瓷,X线衍射分析可见羟基磷灰石及β-磷酸三钙特异性的衍射峰。扫描电镜可见双相钙磷陶瓷表面广泛分布大孔及连通孔,孔壁粗糙不平,孔内可见均匀分布的微孔。鬼笔环肽及DAPI染色显示,骨髓充质干细胞在材料表面伸展黏附,共培养后逐渐从不规则形转变为均一的长梭形。CCK8法提示共培养后第1天,细胞活力降低,而第3、4、5、7天,细胞增殖活力逐渐增加。碱性磷酸酶活性检测提示,与对照组相比,共培养后第1、7天,双相钙磷陶瓷组的骨髓间充质干细胞可分泌更多的碱性磷酸酶。双相钙磷陶瓷顺利置入比格犬竖脊肌内,术后8周材料孔隙内可见骨样组织沉积,术后12周大孔成骨比例为0.77±0.11,孔内成骨面积比例为0.71±0.14。结论双相钙磷陶瓷具有良好的生物相容性及异位骨诱导效率。     

复合富血小板血浆的硼酸盐生物玻璃修复兔实验性骨缺损

目的 评价复合富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)的硼酸盐生物玻璃在兔体内的成骨作用.方法 取36只新西兰大白兔建立双侧桡骨1.5 cm骨缺损模型,随机分为4组,每组9只.A组一侧植入双碱硼酸盐(D-Alk-1B)材料,对侧植入D-Alk-1B+PRP;B组一侧植入D-Alk-1B+PRP,对侧植入β-磷酸三钙(β-TCP);C组一侧植入β-TCP,对侧为实验骨缺损对照;D组一侧植入D-Alk-1B,对侧为实验骨缺损对照.术后4、8、12周取材,通过大体观察、X线片、病理组织学、扫描电镜和Micro-CT评价复合PRP的硼酸盐生物玻璃的成骨作用.结果 术后4、8、12周X线成骨评价和组织学评价结果 基本相似.D-Alk-1B、β-TCP及D-Alk-1B+PRP三组均比实验骨缺损对照组成骨明显(P＜0.05);D-Alk-1B+PRP成骨性能最好,与D-Alk-1B、β-TCP比较差异均有统计学意义(P＜0.05);D-Alk-1B和β-TCP材料成骨性能相似.组织学观察和扫描电镜结果 显示D-Alk-1B的降解速度比β-TCP快,D-Alk-1B+PRP降解速度最快,降解后材料的多孔结构消失.Micro-CT观察提示D-Alk-1B在桡骨骨缺损中和宿主骨骨性结合比β-TCP材料好.结论 新型硼酸盐生物玻璃材料具有良好的生物活性、组织相容性和可降解性.修复骨缺损的能力和β-TCP材料相似,与PRP复合有协同成骨作用.