共转染CDK1、CDK2 siRNA对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

目的 研究共转染CDK1、CDK2 siRNA同时抑制CDK1、CDK2蛋白表达对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响,探讨细胞周期主要调控分子在肿瘤细胞凋亡中的作用.方法 以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,用脂质体lipofectamine2000同时转染CDK1 和CDK2 siRNA.在转染后48、60 h收集细胞,用Western印迹检测CDK1、CDK2蛋白的表达,AnnexinV/PI检测转染细胞的凋亡,流式细胞术DNA含量检测分析细胞周期.转染细胞进行瑞氏-姬姆萨染色(Wright-Giemsa)后在显微镜下观察其形态变化.结果 共转染CDK1、CDK2 siRNA后48和60 h,Western 印迹结果显示CDK1和CDK2蛋白的表达都同时降低.共转染CDK1、CDK2 siRNA后,细胞周期S期和G2/M期比例与对照相比有明显增加;共转染细胞经瑞氏-姬姆萨染色后在显微镜下可见双核或多核细胞增多;AnnexinV/PI检测结果显示共转染CDK1、CDK2 siRNA的细胞在48和60 h细胞凋亡率与对照相比有显著的升高.结论 siRNA 干扰导致的CDK1、CDK2表达同时降低不仅导致细胞周期S期和G2/M期的阻滞,也诱导了肿瘤细胞的凋亡.     

NAC-1特异的siRNA增强紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞凋亡

目的: 探讨 NAC-1 (nucleus accumbens-1)基因特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)联合紫杉醇诱导人卵巢癌HO8910细胞凋亡的协同作用及其可能机制。方法: 测定不同浓度 NAC-1 基因特异的siRNA与紫杉醇单用或者合用对HO8910细胞增殖与凋亡的作用,设立阴性siRNA对照和空白对照。以实时荧光定量RT-PCR 检测NAC-1 mRNA表达水平、Western印迹法检测NAC-1蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)下游信号磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK),以MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡。结果: 单用 NAC-1 基因特异的siRNA作用48 h能抑制HO8910细胞NAC-1 mRNA和蛋白的表达,分别下调71.2%和80.5%,细胞周期被阻滞于G₁期,p-Akt和p-ERK蛋白水平分别下降43.7%和49.8%;作用72 h细胞增殖被抑制45.6%,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,差异显著(P<0.05)。 NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)与紫杉醇(2 μmol/L)联合作用于卵巢癌HO8910细胞72 h细胞凋亡率为(30.93±4.57)%,显著高于单用紫杉醇时的细胞凋亡率[(23.85±3.65)%],P<0.05。结论: 靶向抑制 NAC-1 基因表达能显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖,增强其对紫杉醇的敏感性,这与部分抑制EGFR下游信号途径有关。     

蛋白激酶C在细胞凋亡中的作用

蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）对细胞凋亡有一定的作用。ＰＫＣ的活化可产生二种相反的结果：细胞增殖或细胞凋亡。ＰＫＣ可以通过多途径得以活化，它有多种同工酶，不同的同工酶有不同的功能是产生ＰＫＣ相反作用的主要原因，ＰＫＣ－β的选择性活化可导致细胞凋亡     

肝癌的细胞凋亡及其紫杉醇的诱导作用研究

目的研究肝癌发生过程中原位细胞凋亡活动以及紫杉醇对肝癌细胞系BEL-7404诱导细胞凋亡的作用。方法用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测了肝细胞癌的细胞凋亡,用紫杉醇处理培养细胞BEL-7404、显微镜下进行观察并且进行琼脂糖电泳。结果癌旁组织的原位凋亡细胞增多,紫杉醇处理肝癌细胞可以诱导细胞产生典型的细胞凋亡形态学变化。DNA发生断裂,琼脂糖电泳产生梯形条带。结论在体内肿瘤细胞凋亡降低,细胞分裂可能加快,肿瘤发生。在癌旁组织中细胞凋亡增多,在体外紫杉醇可以诱导肝癌细胞系BEL-7404凋亡。     

蓝萼甲素通过cyclinB1/CDK1途径诱导DU145细胞G2/M期阻滞

目的:研究蓝萼甲素(GLA)调节DU145细胞周期信号通路的表达,探讨GLA阻滞DU145细胞周期的作用机制.方法:不同浓度(1、2.5、5μg/ml)GLA分别刺激培养DU145细胞24 h,CCK8检测细胞增殖;流式检测细胞周期与凋亡;qRT-PCR与Western blot分别检测细胞周期蛋白p21、cyclin...     

缺氧诱导因子-1与细胞凋亡

缺氧诱导因子 1(HIF -1)是一种主要由缺氧诱导细胞产生的重要的转录因子。HIF- 1的表达水平与糖酵解、细胞周期阻滞、细胞生存与增殖、血管新生、血管舒缩、红细胞生成、肿瘤生长,转移以及肿瘤多药耐药等许多生命活动密切相关。HIF- 1通过调控凋亡相关基因的转录在促细胞凋亡和抗细胞凋亡中都发挥着重要的作用。     

白藜芦醇诱导大鼠肝癌细胞凋亡的作用

目的:探讨白藜芦醇(Res)对大鼠肝癌细胞CBRH7919的作用.方法:采用SRB细胞活性检测法检测白藜芦醇对CBRH7919细胞活性的影响;用流式细胞仪检测CBRH7919对细胞周期分布、凋亡、线粒体膜电位的影响.结果:白藜芦醇作用于CBRH7919细胞24、48和72h后,SRB检测细胞活性有时间和浓度依赖性,CBRH7919细胞凋亡率增加,细胞周期阻断于G0～G1期,细胞线粒体膜电位降低.结论:白黎芦醇对大鼠肝癌细胞CBRH7919有明显的抑制作用,可能是通过线粒体凋亡途径诱导细胞的凋亡.     

细胞周期相关新基因CACUL1对培养的结直肠癌细胞凋亡的影响

目的 研究细胞周期相关新基因细胞周期素依赖激酶2相关性Culin结构域1(CACUL1)对肿瘤细胞凋亡的影响,探讨CACUL1与细胞凋亡调控的关系.方法 用紫外线及化疗药物诱导细胞周期的阻滞,研究CACUL1在细胞DNA损伤状态下表达情况;同时用p53野生型及敲除的结直肠癌细胞,应用Western blot、Northern blot等方法检测了CACUL1蛋白及mRNA表达与p53的关系.结果 与细胞凋亡的调控有关,在紫外线及化疗药物诱导的DNA损伤情况下,CACUL1蛋白的表达在2h达最高,随着时间的逐渐延长,CACUL1的表达逐渐减低,而这种表达的增高是p53非依赖性的,Northern blot结果显示CACUL1的表达增高是转录后调控机制.CACUL1的高表达能够抑制紫外线及化疗药物诱导的细胞凋亡.结论 CACUL1在细胞凋亡中的作用是以一种转录后调控的p53非依赖方式帮助细胞跨过G1/S检控点,利于细胞生存.     

细胞内钙离子螯合剂抑制HSV-1诱导Hela细胞的凋亡作用

目的：探讨HSV-1在诱导Hela细胞凋亡中，细胞内游离钙浓度的变化及钙离子螯合剂对HSV-1诱导Hela细胞凋亡的抑制作用。方法：HSV-1感染Hela细胞后，用扫描电镜及透射电镜观察凋亡情况。用荧光探针标记细胞内游离Ca^2 ，在不同时间观察细胞内游离Ca^2 浓度的变化。结果：HSV-1感染Hela细胞后，出现了典型的凋亡形态学变化。细胞内游离Ca^2 浓度在HSV-1感染Hela细胞后12h达高峰；典型的凋亡形态学变化出现在HSV-1感染Hela细胞后24h。细胞内Ca^2 螯合剂能显著抑制HSV-1诱导的Hela细胞凋亡。结论：细胞内游离Ca^2 在HSV-1诱导的Hela细胞凋亡过程中，具有重要作用，此实验结果为临床治疗相关疾病提供了有用的线索。     

蜈蚣提取物诱导SiHa细胞凋亡及其作用机制

目的研究蜈蚣提取物对宫颈癌SiHa细胞生长的抑制及其作用机制。方法观察不同浓度的不同蜈蚣提取物对宫颈癌SiHa细胞的生长抑制情况:以不同浓度的蜈蚣提取物和顺铂作用于SiHa细胞48h,MTT法测定药物对细胞生长的影响,流式细胞术观察DNA含量和凋亡的改变,DNA片断化分析凋亡特有DNA梯形格局,Western blot测定bax、Caspase3蛋白水平的表达。结果SiHa细胞用8、16、32mg/mL的乙醚、乙醇蜈蚣提取物处理48h后,细胞生长显著受抑制;DNA周期改变明显,亚G1峰与对照组有显著性差异;DNA-Ladder显著;Western blot提示相关凋亡蛋白bax、Caspase3表达并显示活性,凋亡率增高明显。结论中药蜈蚣乙醚、乙醇提取物在体外对宫颈癌SiHa细胞的生长有明显地抑制作用,机制与改变细胞DNA周期,促进凋亡有关。     

siRNA下调FLAP的表达诱导胰腺癌细胞PANC-1凋亡

目的研究5-脂氧合酶激活蛋白(5′-lipoxygenase activating protein,FLAP或ALOX5AP)的表达抑制对胰腺癌细胞PANC-1凋亡的诱导作用。方法通过siRNA抑制胰腺癌细胞FLAP的表达,用流式细胞仪检测Annexin-V标记的凋亡细胞,用Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白的表达和裂解水平。结果FLAPsiRNA有效抑制了胰腺癌细胞PANC-1中FLAP的表达。转染了FLAP siRNA的胰腺癌细胞出现凋亡。在细胞凋亡过程中,Bcl-2水平下降,而细胞色素C、caspase-3水平逐渐增高。结论FLAP的表达抑制可以诱导乳腺癌细胞通过Bcl-2和caspase-3途径发生凋亡。     

性别对T细胞受体抗体诱导的小鼠胸腺细胞亚群凋亡的影响

为分析抗TCR抗体诱导小鼠胸腺细胞的凋亡与性别的关系。用抗TCR抗体腹腔注射、体外包被诱导不同性别小鼠胸腺细胞的凋亡 ,并体外分析雌、雄小鼠在细胞周期凋亡敏感性的差异。腹腔注射抗TCR抗体 4 8h后 ,BALB/c小鼠成熟髓质区高表达TCR的单阳性细胞数目 (CD4 + CD8 、CD4 CD8+ )成倍增加 ,同时皮质区低表达TCR的不成熟双阳性细胞 (CD4 +CD8+ )数目减少。雄性小鼠的这种变化明显于雌性小鼠 ,体外刺激显示类似的结果。抗TCR抗体诱导的凋亡与G0 /G1期细胞的减少有关。结果表明不同性别小鼠在细胞凋亡的敏感性上有差异 ,雄性小鼠更易感。     

Cell cycle regulation and its aberrations in human lung carcinoma

Cell cycle is strictly regulated by complex and redundant mechanisms. Basically, cell cycle transition is promoted by accelerator molecules termed 'cyclin' and 'cyclin-dependent kinase' (cdk), and inhibited by brake molecules termed 'cdk-inhibitor' (CKI). Although based on the results of early experimental studies and of clinicopathological analyses, there was much speculation that gene aberration of those molecules would be common; this has not turned out to be the case. One reason may be that activation or inactivation of a single molecule by itself usually does not lead to cell transformation, but rather to apoptosis. Successful transformation and unchecked cell proliferation appears to require the coordinated up-regulation of cyclin/cdk and/or suppression of CKI. In this article, I focus on the precise regulation of the cell cycle and describe abnormalities found in these proteins in lung carcinoma. Notable findings in lung carcinoma include: (i) cyclin A/cdk2 plays a key role in cell proliferation, while protein amount of cyclin E does not necessarily reflect cellular proliferative activity, depending on the tumor type; (ii) CKI function not only as suppressors, but also as activators of cdk, depending on expression levels; and (iii) aberrant expression of cyclin/cdk can lead to apoptosis in vivo in humans. Another key point is that as lung carcinoma is composed of a mixture of heterogeneous histological subtypes, the growth control of carcinoma cells is diversely regulated, depending on each histological subtype. This diversity is also described with our experimental results.     

细胞周期检测点激酶1的研究进展

细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)是一种进化上高度保守的蛋白质激酶,在S期、G_2/M检测点调控细胞周期的进程。受损的DNA可活化Chk1,引起细胞周期阻滞,使受损的DNA得以修复;若损伤广泛而无法修复时则诱导凋亡,从而维持基因组的完整性和稳定性。Chk1缺失的肿瘤细胞表现出多重缺陷,如:细胞增殖缓慢、细胞周期检测点的反应消失、对DNA损伤剂的敏感性增加。由于Chk1的抗损伤作用,Chk1在肿瘤的发生发展、凋亡和耐药机制中起重要作用。     

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的：构建MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法：构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果：成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快（P＜0.01）,经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论：小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.     

PLK1在细胞周期生物学的研究进展

PLK1(polo like kinase)是一类广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶,其结构及功能均十分保守。研究表明,plk1在启动、维持及完成有丝分裂中扮演重要角色,plk1磷酸化多种下游底物而实现其功能。已发现plk1基因在多种恶性肿瘤中存在过表达并与某些肿瘤的生物学行为及预后相关,有望成为恶性肿瘤的又一新的标记物,阻断plk1表达可导致体外肿瘤细胞分裂停滞及凋亡。     

RNA干扰EP—CAM基因表达对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：利用RNA干扰技术抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子（EP-CAM）基因的表达,探讨抑制EP-CAM基因后对GBC-SD细胞增殖、凋亡的影响.方法：构建靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒,转染GBC-SD细胞,用RT-PCR和Western Blot分别检测EP-CAM基因的mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果：靶向EP-CAM的miRNA重组质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1构建成功,重组质粒能显著抑制靶基因EP-CAM的mRNA及蛋白表达.与对照组比较,干扰后的细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）,但细胞增殖活性受到明显抑制（P＜0.05）.结论：靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒能有效抑制EP-CAM基因的表达,抑制GBC-SD细胞的增殖.     

Hax-1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨Hax-1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响.方法:MTT法、 AnnexinV-FITC/PI染色、 Hoechst 33258染色、 Western blot检测Hax-1 siRNA联合顺铂或苦参碱对细胞增殖、凋亡和caspase-3活性形式表达的影响.结果:相同药物浓度作用下, Hax-1 siRNA转染组细胞抑制率、凋亡率及cleaved caspase-3表达明显高于未转染组和转染无关载体组(P＜ 0.05);荧光显微镜下观察, 相同药物浓度作用下, Hax-1 siRNA转染组细胞凋亡现象较明显.结论:Hax-1 siRNA增强顺铂或苦参碱对黑素瘤A375细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用, 该作用可能和caspase-3的活性形式表达增强相关.     

Preferential S Phase Entry and Apoptosis of CD4 T Lymphocytes of HIV-1-Infected Patients after in Vitro Cultivation

We have studied the relationship between spontaneous apoptosis and cell cycle perturbations in circulating peripheral blood lymphocytes of HIV-1-infected patients and healthy controls. PBMC obtained from HIV-1-infected patients and healthy controls were incubated in culture medium for 48 h. Cells were separated into CD4⁺ and CD8⁺ populations using immunomagnetic beads. Apoptosis and cell cycle phases were measured by propidium iodide staining and bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation followed by flow cytometric analyses. In experiments using cells obtained from HIV-1-infected patients, spontaneous apoptosis was more frequent in CD4⁺ T lymphocytes than in CD8⁺ T lymphocytes (17.6% vs 9.5%, P < 0.005). Among healthy controls, spontaneous apoptosis in CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes was comparable (4.5% vs 5.1%). Lymphocytes obtained from patients were more frequently in S phase than healthy controls' cells (2.2 ± 0.9% vs 0.5 ± 0.2%, P < 0.002) and patients' CD4⁺ cells tended to enter S phase more frequently than controls' CD4⁺ cells (4.2% ± 3.5% vs 1.8% ± 0.5% P < 0.04), whereas the frequency of S phase CD8⁺ T cells was not different among patients (2.8% ± 2.9%) and controls (1.8% ± 0.5%) (P > 0.4). Kinetic analyses using BrdU and PI staining revealed that S phase cells were more likely to become apoptotic than resting (G₀–G₁) cells (28.4% ± 10.3% vs 11.3% ± 9.9% in patients, P < 0.04, and 15.3% ± 2.8% vs 1.8% ± 0.5% in controls, P < 0.003). Lymphocytes obtained from HIV-1-infected persons are activated in vivo to enter S phase and to undergo spontaneous apoptosis after brief in vitro cultivation. The present studies indicate that most apoptotic cells in this system are CD4⁺ and kinetic analyses reveal that S phase cells are more likely to undergo spontaneous apoptosis than G₀–G₁ cells. Accelerated cell death in HIV-1 disease may contribute to the failure of lymphocyte responsiveness to appropriate T cell receptor stimulation.