人喉癌新的相关基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的:寻找喉癌新的相关基因,阐明喉癌发生的分子机制,为喉癌的基因诊治提供研究的靶基因。方法:应用mRNA差异显示方法对喉癌患者的癌旁、癌及颈部转移淋巴结组织差异cDNA进行了筛选、克隆和测序,并对其进行了鉴定和同源性分析。结果:筛选出7个差异cDNA片段,克隆并鉴定了其中两个与喉癌发生相关的cDNA片段,它们与多种肿瘤相关基因的cDNA序列同源。结论:克隆的两个cDNA片段可能是喉癌新的相关基因cDNA片段,全长cDNA克隆及深入研究其功能有助于发现喉癌新的相关基因。     

克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549^DDP耐药相关基因的差异表达片段

目的：克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示法技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549^DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序,同源性分析,其中2个片段（A1、D1）在GeneBank中未发现同源序列,一个片段（A2）与白介素－1β转化酶（Interleukin 1 β怀脲,ICE）89％同源性,一个片段（D2）与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100％同源。A1、A2cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2cDNA片段仅表达于A549^DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549^DDP间的基因差异3表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

克隆肺腺癌亲代细胞A_(549)与耐顺铂细胞A_(549)~(DDP)耐药相关基因的差异表达片段

目的　克隆肺腺癌耐药相关基因。方法　以mRNA差异显示技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A54 9DDP及其亲代细胞A54 9基因表达的差异。差异表达基因片段被克隆并经Northernblot证实。结果获得 4个基因表达的差异cDNA片段 ,经测序、同源性分析 ,其中 2个片段 (A1、D1)在GeneBank中未发现同源序列 ,一个片段 (A2 )与白介素 1β转化酶 (Interleukin 1βconvertingenzyme ,ICE) 89%同源性 ,一个片段 (D2 )与MM45srRNA(Mousemusculus 45spre rRNA)基因 10 0 %同源。A1、A2 cDNA片段仅表达于A54 9细胞 ,D1、D2 cDNA片段仅表达于A54 9DDP细胞。结论　应用mRNA差异显示技术获得 4个肺腺癌A54 9与A54 9DDP间的基因差异表达片段。 2个新的差异表达片段以及与ICE、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

应用mRNA差异显示技术克隆甲状腺癌相关基因

目的：筛选并克隆甲状腺乳头状癌、甲状腺未分化癌与其正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：应用mRNA差异显示技术克隆与鉴定出差异的cDNA片断，并对其进行NCBI GenBank数据库同源性检索。结果：成功亚克隆出8个基因片段，进行GenBank数据库同源性检索，这些基因可能与甲状腺癌的发生相关，尤其在甲状腺未分化癌及乳头状癌中均见与LMAN1基因同源的差异带，提示LMAN1基因很可能为甲状腺癌相关基因。结论：获得的差异表达片段为进一步克隆甲状腺癌相关基因及功能研究奠定了良好的基础。     

mRNA差异显示法筛选和克隆胃癌相关基因

目的 :筛选和克隆胃印戒细胞癌与正常胃黏膜细胞差异表达基因片段。方法 :采用mRNA差异显示法 (mRNAdifferentialdisplayPCR ,DD PCR) ,对比胃印戒细胞癌组织与正常胃黏膜组织mRNA的表达差异 ,克隆胃印戒细胞癌差异片段 ,经过RNA的斑点杂交、测序以及序列分析和同源性比较。结果 :胃印戒细胞癌与正常胃黏膜中存在明显的基因表达差异 ,发现与胃癌相关的差异表达条带 16条 ,其中 7条为缺失表达条带 ,9条为过度表达条带。对其中 4条差异表达条带进行克隆、测序 ,经序列分析及同源性比较和RNA的斑点杂交 ,表明确认其中 1条为GenBank/BLAST中尚未收录的片段。结论 :胃印戒细胞癌的mRNA差异显示证明 ,该EST序列可能在胃癌的发生发展中具有一定作用     

胃癌相关基因gcI的克隆及其功能预测

目的:应用生物信息学平台对胃癌相关基因表达片段进行cDNA全长克隆及序列分析和蛋白功能预测.方法:选用人胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织经mRNA差异显示技术筛选获得的差异表达片段,对所获得的1条功能未知基因表达片段"Ⅰ",利用5'cDNA末端快速扩增方法扩增全长cDNA,结合Northern杂交印迹方法进行验证分析;利用NCBI、EMBL数据库资源分析其编码氨基酸的生物学特征以及预测其编码蛋白的功能.结果:扩增得到序列Ⅰ的全长cDNA,命名为gcI.分析显示gcI含有2个跨膜区,定位于胞膜;含有3个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N端豆蔻酰化作用位点.结论:克隆的胃癌相关基因表达全长序列gcI、编码与信号转导有关的跨膜蛋白,可能是参与胃癌发生过程中的相关基因.     

p53调控的肺癌细胞顺铂敏感性相关基因片段的分离和克隆

目的 克隆野生型p53(wtp53)影响人大细胞肺癌801一D细胞系顺铂敏感性相关基因片段。方法 采用转基因方法补偿801-D细胞p53功能，分别提取经IC50浓度顺铂刺激的转染wtp53细胞、空载细胞和未经顺铂作用的转wtp53细胞RNA，用银染mRNA差异显示方法分离差异表达基因，反转录点杂交和巢式PCR进行确证。阳性片段进行克隆及序列分析。结果 获得6条阳性片段，2条含有开放阅读框架(ORF)，其中1条片段部分与核糖核苷还原酶α链有56％同源性，另一片段D1含有一个长ORF，与已知cDNA序列同源率很低。结论 p53对801-D细胞顺铂敏感性的影响有明显的基因水平改变，可能诱导了相关基因表达。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原

背景与目的 目前用于非小细胞肺癌诊断的标志物为数不多,为寻找更多的早期诊断和靶向治疗相关的标志物,本研究应用SEREX技术筛选与鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原.方法 使用非小细胞肺癌患者血清对人肺鳞癌和腺癌噬菌体展示文库进行生物淘选和SEREX筛选.PCR扩增阳性克隆插入片段后测序,结果 与GeneBank数据库中已知基因进行同源性比较,分析其生物学特性.结果用非小细胞肺癌血清对噬菌体展示文库进行筛选,共获得31个阳性克隆,测序后发现其代表15个基因,其中12个与已知cDNA序列同源,与肺癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另外3个未发现有同源基因,可能是新基因.结论 应用SEREX技术发现15个肺癌相关抗原和3个肺癌相关抗原的候选基因,为进一步的深入研究打下良好的基础.     

人高、低转移肺大细胞癌细胞系的mRNA差异显示研究

目的 通过研究人高、低转移肺大细胞癌细胞系基冈差异表达谱，克隆与肿瘤转移相关的基因。方法 应用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)对高、低转移人肺大细胞癌细胞系的mRNA进行差异显示，切胶回收差异表达cDNA，克隆测序后与GenBank数据库进行Blast比对。结果 获得差异表达cDNA50条，其中已知功能基因18条，末知功能基因16条，DNA来源16条，EST4条。结论 人高、低转移肺大细胞癌细胞系的基因表达差异较大，转移的过程受基因的表达与调控的影响。应用DDRT-PCR技术有单找到调控肿瘤转移的基因，为肿瘤的诊断和治疗提供新的线索。     

mRNA差异显示法筛选和克隆胃癌相关基因

目的：筛选和克隆胃印戒细胞癌与正常胃黏膜细胞差异表达基因片段。方法：采用mRNA差异显示法(mRNA differential dlsplay PCR，DD-PCR)，对比胃印戒细胞癌组织与正常胃黏膜组织mRNA的表达差异，克隆胃印戒细胞癌差异片段，经过RNA的斑点杂交、测序以及序列分析和同源性比较。结果：胃印戒细胞癌与正常胃黏膜中存在明显的基因表达差异，发现与胃癌相关的差异表达条带16条，其中7条为缺失表达条带，9条为过度表达条带。对其中4条差异表达条带进行克隆、测序，经序列分析及同源性比较和RNA的斑点杂交，表明确认其中1条为GenBank／BLAST中尚未收录的片段。结论：胃印戒细胞癌的mRNA差异显示证明，该EST序列可能在胃癌的发生发展中具有一定作用。     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

胃癌及癌前病变差异表达基因的初步研究

目的:寻找胃癌、癌前病变中差异表达的基因,以确定胃癌发生前胃粘膜的分子变化方法:应用荧光mRNA差异显示技术分析胃癌(3例)、癌前病变(3例)和正常胃粘膜(3例),鉴别并分离差异表达的基因片段,进行PCR再扩增将扩增的cDNA片段克隆后测序,测序结果提交GenBank,经BLASTN软件检索以进行同源性分析.差异条带经Northern印迹验证.结果:发现2个差异表达的cDNA片段,1个在正常组织和癌前病变中高表达的cDNA片段在GenBank数据库中未找到同源序列,获得GenBank登陆号CB833297,并由UNIGENE基因库收录,为新基因片段.另1个在正常胃粘膜组织中高表达的cDNA片段,在GenBank数据库中与RP11-315A19克隆高度同源,但其功能目前尚不清楚.结论:本研究发现的2个在胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织中差异表达的基因,它们可能参与了胃癌的发病过程.     

hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了hSesn3蛋白.     

胃癌相关基因gcl的克隆及其功能预测

目的：应用生物信息学平台对胃癌相关基因表达片段进行cDNA全长克隆及序列分析和蛋白功能预测。方法：选用人胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织经mRNA差异显示技术筛选获得的差异表达片段，对所获得的1条功能未知基因表达片段“I”，利用5＇cDNA末端快速扩增方法扩增全长cDNA，结合Northern杂交印迹方法进行验证分析：利用NCBI、EMBL数据库资源分析其编码氨基酸的生物学特征以及预测其编码蛋白的功能。结果：扩增得到序列I的全长cDNA，命名为geI。分析显示gcI含有2个跨膜区，定位于胞膜；含有3个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N端豆蔻酰化作用位点。结论：克隆的胃癌相关基因表达全长序列geI、编码与信号转导有关的跨膜蛋白，可能是参与胃癌发生过程中的相关基因。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

hnRNP A2/B1基因克隆及在肺癌组织中表达的初步探讨

背景与目的目前肺癌治疗中存在无早期特异性诊断指标的难题.本研究旨在获得hnRNPA2/B1 cDNA序列,研究其在肺癌组织中的表达情况,为肺癌早期诊断治疗提供实验依据.方法从培养的A549肺腺癌细胞中提取总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的片段,将其克隆于PUCm-T质粒上,并经酶切电泳、DNA测序鉴定分析.采用原位杂交方法,利用特异的cDNA探针,检测41例肺癌、13例非肺癌组织中hnRNP A2/B1的表达情况.结果从培养的A549肺腺癌细胞提取的总RNA中扩增到目的片段,并经测序证实该片段为hnRNP A2/B1编码序列.原位杂交显示肺癌组hnRNP A2/B1阳性率为87.8%(36/41),显著高于非肺癌组23.1%(3/13)(P＜0.01).其在胞浆、胞核均有表达,主要在胞浆表达.四种类型肺癌组织均显示hnRNP A2/B1阳性染色,其中鳞癌细胞染色阳性率为91.3%(21/23),似高于腺癌细胞78.6%(11/14),但两组间无显著性差异(P ＞0.05).结论hnRNP A2/B1可以被成功克隆.初步证实hnRNP A2/B1在肺癌组织中呈高表达,但与肺癌组织类型无明显关系.     

肺癌耐药相关基因在肺癌组织和肺癌细胞株中的表达

背景与目的：我们已经通过抑制消减杂交技术发现了一条新的长494bp的肺癌耐药相关基因片段,并克隆了它的全长cDNA序列。本研究旨在研究该肺癌耐药相关基因（lung cancer drug resistance-related gene,LCDRG）在肺癌组织、癌旁组织及5种肺癌细胞株中的表达。方法：应用半定量RT－PCR检测38例肺癌组织、12例癌旁组织和5种肺癌细胞株中该基因的表达。结果：肺癌组织中LCDRG mRNA的表达明显高于癌旁组织（P＜0．001）,但在肺腺癌和鳞癌之间差异无统计学意义。该基因在肺腺癌细胞株SPC－A－1和A549、大细胞肺癌细胞株H460、小细胞肺癌细胞株H446和SH77中的表达依次递减。结论：LCDRG是一条肺癌相关基因,该基因可能与肺癌的发生、发展密切相关。     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。