荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测外周血Wilm‘s瘤基因的表达

Ｗｉｌｍ′ｓ瘤基因 (ＷＴ1)位于人类染色体 11Ｐ13,与Ｗｉｌｍ′ｓ瘤的发生密切相关。近年发现ＷＴ1在白血病细胞中高度表达[1] ,可作为检测微小残留病 (ＭＲＤ)的指标。为此我们采用荧光定量逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)技术 ,检测了不同类型白血病患者外周血ＷＴ1的表达水平 ,现报道如下。一、材料和方法1 标本 :6 9例白血病患者均符合ＦＡＢ诊断标准 ,年龄2 2～ 70岁。对照组为 18例非白血病患者和健康志愿者 14名 ,年龄 2 1～ 2 4岁。2 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成 :2ｍｌＥＤＴＡ抗凝血 ,提取外周血总ＲＮＡ ,2 6 0～ 2 80ｎ…     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测慢性肝病患者单个核细胞中TGF-β1的表达水平

目的建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQRTPCR)方法,检测慢性肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)中TGFβ1表达水平。方法构建TGFβ1质粒克隆,以T7RNA聚合酶体外转录合成带有目的片断的cRNA作为标准品,在PCR反应体系中加入与模板互补的TaqManMGB探针建立荧光定量RTPCR,检测PBMC中TGFβ1mRNA含量,并对本方法进行方法学评价;同时检测血浆TGFβ1水平。结果重组质粒测序证明插入的片断为TGFβ1特异性片断,荧光定量RTPCR检测TGFβ1mRNA的灵敏度达6.81拷贝,线性范围为6.81～6.81×108拷贝,批内、批间变异系数分别为1.28%～2.27%和2.56%～2.61%,临床应用显示,慢性乙型肝炎中、重度患者及肝炎后肝硬化患者PBMC中TGFβ1mRNA含量及血浆TGFβ1水平均显著高于正常(P<0.05)。结论荧光定量RTPCR检测TGFβ1mRNA具有敏感、特异、快速等特点,为TGFβ1mRNA作为肝纤维化的诊断指标提供方法学依据。     

荧光定量聚合酶链反应检测肝病患者HBV DNA

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)法的临床应用价值。方法　采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和FQ PCR法对 2 4 0例不同的肝病患者及 10 8例健康体检者进行乙型肝炎病毒标志物 (HBVM )以及HBVDNA定量检测。结果　不同临床类型 (急慢性乙肝患者、肝硬化和肝癌 )患者血清中HBVDNA的阳性检出率的差异具有显著性 (x2 =9.4 0 ,P <0 .0 5 ) ;不同人群血清中HBVDNA阳性检出率的差异亦具有显著性 (x2=12 5 .31,P <0 .0 0 1)。ELISA检测结果为“HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)”和“HBsAg(+)HBeAb(+)HB cAb(+)”的HBV感染者 ,体内HBVDNA含量显著高于HBVM阴性者 ;e抗原阳性和阴性者体内HBVDNA含量的差异亦具有显著性。HBV、HCV重叠感染者血清HBVDNA含量明显低于单纯HBV感染者 (P <0 .0 5 )。结论　FQ PCR法检测HBVDNA具有灵敏度高、特异性好、结果可靠的优点 ,可反映HBV真实感染和低复制状态 ,对于乙肝的临床诊断、治疗方案选择和预后判断具有重要的指导意义     

荧光定量聚合酶链反应在患儿巨细胞病毒感染快速检测中的应用

巨细胞病毒 (HCMV)感染分原发性感染、潜伏性感染和激活性感染。患儿HCMV感染多为原发性感染 ,尤其是新生儿HCMV感染主要通过母体在宫内感染引起母婴垂直传播或分娩时通过产道或哺乳期通过乳汁传播婴儿[1] 。HCMV一旦感染终生相伴 ,通常无症状 ,病毒潜伏在宿主细胞中 ,多种诱因可使潜伏的病毒被激活 ,而引发明显的临床症状。小儿先天性或获得性感染HCMV可引起婴儿肝炎综合征、生长发育受阻或中枢神经系统障碍、神经性耳聋等并发症 ,其后果非常严重。HCMV感染的诊断通常检测血清中HCMV IgG和IgM抗体 ,或采用核酸杂交和聚合酶链…     

荧光定量聚合酶链反应检测肝病患者HBV DNA

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法的临床应用价值.方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和FQ-PCR法对240例不同的肝病患者及108例健康体检者进行乙型肝炎病毒标志物(HBVM)以及HBV DNA定量检测.结果不同临床类型(急慢性乙肝患者、肝硬化和肝癌)患者血清中HBV DNA的阳性检出率的差异具有显著性(x2=9.40,P<0.05);不同人群血清中HBV DNA阳性检出率的差异亦具有显著性(x2=125.31,P<0.001).ELISA检测结果为"HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)"和"HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)"的HBV感染者,体内HBV DNA含量显著高于HBVM阴性者;e抗原阳性和阴性者体内HBV DNA含量的差异亦具有显著性.HBV、HCV重叠感染者血清HBV DNA含量明显低于单纯HBV感染者(P<0.05).结论 FQ-PCR法检测HBV DNA具有灵敏度高、特异性好、结果可靠的优点,可反映HBV真实感染和低复制状态,对于乙肝的临床诊断、治疗方案选择和预后判断具有重要的指导意义.     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测高苯丙氨酸对2种神经元发育相关基因表达的影响

目的 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)，研究高苯丙氨酸对神经元发育相关基因表达的影响。方法 在体外培养3d的原代胚鼠大脑皮层神经元中，加入高苯丙氨酸诱导12h，用实时荧光定量RT—PCR方法，检测高苯丙氨酸对胚鼠大脑皮层神经元生长相关蛋白43(GAP-43)和鸟苷酸结合蛋白α1(Goα1)基因的影响。结果 胚鼠大脑皮层神经元经高苯丙氨酸诱导，其GAP-43基因表达较正常对照增高2．25倍，Goαl较正常对照降低3．31倍。结论 高苯丙氨酸可能通过影响GAP-43和Goαl基因表达，干扰大脑皮层神经元正常生长发育。     

荧光定量聚合酶链反应检测肺癌患者血清循环DNA的临床应用

循环DNA是指存在于血液、滑膜液等体液中的细胞外DNA ,主要以DNA蛋白质复合物的形式存在 ,部分为游离DNA。其在体液中处于一种动态平衡过程 ,由细胞受外源刺激后主动分泌或者细胞损伤或死亡后释放产生[1]。其变化与临床多种疾病 ,尤其是肿瘤有关。本研究用建立的循环DNA提取和定量检测方法 ,对临床不同疾病的血清中循环DNA水平进行研究。一、材料和方法1.标本来源 :随机选择 2 0 0 2年 4月至 6月本院经病理确诊为肺癌患者的血清标本 40份 ,年龄 52～ 84岁 ;肝癌标本 40份 ,年龄 46～ 76岁 ;门诊收集健康体检者血清 3 0份 ,年龄 50～…     

逆转录聚合酶链反应法检测胃癌患者外周血细胞角蛋白19表达

目的　探讨胃癌患者外周血中细胞角蛋白 19(CK19)的表达及其与临床病理的联系。方法　5 7例胃癌患者中 ,39例接受切除性手术治疗 ,18例接受化疗。采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测CK19mRNA的表达 ,并与 2 0例健康志愿者 (对照组 )进行比较。结果　胃癌患者外周血中的CK19mRNA的表达率为 2 2 .8% (13/ 5 7) ,对照组为零。外周血中CK19的表达与TNM分期有关 ,而与淋巴结转移及肿瘤细胞分化之间的差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,同时也与癌胚抗原 (CEA)、碳水化合物抗原 (CA 19 9)无关(P >0 .0 5 )。结论　CK19的检测有助于胃癌患者明确分期、判断预后及指导治疗 ,是一种比较特异而且敏感的胃癌微小瘤灶的组织特异性标记物。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应在前列腺特异性抗原基因检测中的应用价值

目的　利用Taqman技术 ,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应 (FQ RT PCR)技术 ,对前列腺癌病人外周血中前列腺特异性抗原基因 (PSAmRNA)进行定量检测。方法　在PSA基因的外显子 2和 3之间设计一对引物和一条Taqman探针 ;优化反应体系的条件 ,以不同LNCaP细胞含量为标准品和其循环阈值 (Ct值 )制作标准曲线 ,检测外周血中PSAmRNA含量 ;对本方法进行方法学评价及初步临床应用评价。结果　成功建立了FQ RT PCR检测PSAmRNA技术 ,本方法最低检测限为每毫升全血 5个LNCap细胞 ,线性范围为 5～ 1 0 8细胞 /ml,批内和批间变异系数分别为 9 5 %～1 4 3%和 1 5 2 %～ 2 0 1 % ,扩增产物克隆和测序分析显示本扩增片段为PSAmRNA序列的特异性片段。初步临床研究显示 ,1 0例经ECT ,检查证实骨转移的前列腺癌患者的外周血均检到PSAmRNA ,其含量变化为 8～ 1 0 4细胞 /ml,健康男性、女性各 5名外周血中PSAmRNA含量均小于本法最低检测限。结论　荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PSAmRNA具有灵敏、特异、简便、结果数据化等特点 ,该方法可为前列腺癌微转移诊断、预后判断、指导治疗等奠定良好基础 ,同时也为其他肿瘤患者外周血中肿瘤细胞检测提供了方法学启示     

MAGE-1基因在胃癌中的表达及其意义

目的探讨MACE-1(黑色素瘤抗原-1)基因在胃癌组织中的表达及意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测58例胃癌组织及30例正常组织中MAGE-1基因表达。结果58例胃癌组织标本中有34例(58.6%)表达MAGE-1基因,而30例正常组织均不表达MAGE-1基因,两组比较差弄有显著性(P<0.05)。结论MAGE-1基因在胃癌组织中有较高的表达,对胃癌病人的免疫治疗和预后有重要意义。     

实时荧光定量端粒重复扩增法检测大肠癌患者单个核细胞端粒酶基因表达

目的 研究大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)端粒酶基因表达与临床病理的关系.方法 用实时荧光定量端粒重复扩增法(RTQ-TRAP)检测71例大肠癌和20例良性大肠疾病患者,以及25名健康人PBMC端粒酶基因表达,同时检测大肠癌患者血浆癌胚抗原(CEA)含量.结果 71例大肠癌患者中,50例端粒酶基因表达阳性,阳性率70.4%;20例良性大肠疾病表达阳性1例,阳性率为5.0%,大肠癌组与良性大肠疾病组和健康对照组的PBMC端粒酶基因表达差异有统计学意义(χ2=24.521,P<0.001).大肠癌患者在不同性别(χ2=0.114,P=0.736)、年龄(χ2=0.113,P=0.735)、肿瘤部位(χ2=1.523,P=0.677)、Dukes分期(χ2=2.282,P=0.320)间的端粒酶基因表达差异无统计学意义.71例大肠癌患者PBMC端粒酶基因表达阳性率与CEA阳性率(63.4%)比较,差异无统计学意义(χ2=2.286,P=0.125).结论 RTQ-TRAP是一种快速、准确、定量检测端粒酶基因表达的方法,大肠癌患者PBMC端粒酶活性是一项有效的辅助诊断大肠癌的分子标志.     

荧光定量聚合酶链反应检测CCND1基因扩增在乳腺癌诊断中的应用

目的应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测细胞周期蛋白D1（CCND1）基因表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用价值。方法应用FQ-PCR法,并以β2-微球蛋白为内对照测定15例健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中CCND1的表达量。结果CCND1表达水平在健康对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义（P〉0．05）,乳腺癌组均高于前2组（P〈0．05）,β2-微球蛋白在3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。81例乳腺癌患者阳性率为45．7％,良性乳腺疾病组为0。结论FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测CCND1方法,可有效监测乳腺癌的诊断：疗效、转移,评估其预后。     

胃癌患者外周血CK20 mRNA的表达及临床意义

目的探讨胃癌患者外周血中CK20 mRNA的表达水平及与临床病理因素的相关性,评价其在微转移中的诊断意义。方法运用巢式逆转录-聚合酶链反应检测46例胃癌患者外周血CK20 mRNA的表达情况,并以20例慢性胃炎患者和20例健康志愿者作对照。结果胃癌组外周血CK20 mRNA阳性表达率为60．8％（29／46）,而慢性胃炎组和健康志愿者组均表达阴性,差异均有统计学意义（P〈0.0001）;胃癌组CK20 mRNA的阳性表达率与胃癌分化状态、TNM分期和有无淋巴结转移相关（均P〈0．05）,而与年龄、性别、肿瘤大小和浸润深度无关。结论胃癌患者外周血中CK20 mRNA的阳性表达可作为胃癌早期诊断及微转移的判断指标,可对临床分期、预后判断和治疗起指导作用。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

用实时荧光定量PCR检测NAT2基因型及其意义

目的 探讨深圳地区汉族人中NAT2基因分布特征,为开展NAT2基因与肿瘤相关性研究和药物代谢性疾病诊治提供依据。方法将DNA浓度为40 ng/μl的标本进行1×100、1×101、1×102、1 ×103、1 ×104倍比梯度稀释,以验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度。采用实时荧光定量PCR结合TaqMan探针技术检测554名深圳汉族健康人NAT2基因282、341、481、590和857突变位点,并进行基因分型。同时用直接测序法对47名健康人标本进行平行检测,以验证和评价荧光定量PCR检测NAT2基因的敏感度、特异度和准确性。结果 经倍比梯度稀释试验验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度可精确至10-4ng/μl。采用实时荧光定量PCR从554名深圳汉族人中检出NAT2*4、*5、*6、*7、*11等位基因频率分别为64.6％( 358/554)、6.3％( 35/554)、25.3％ (140/554)、30.0％( 166/554)、0.6％( 3/554)。主要基因型NAT2* 4/*6、*6/*7、*13/*13或*12/*12或*4/*4、*4/*7、*7/*13、*12、*6/*13(*12)频率依次为12.3％(68/554)、8.3％ (46/554)、7.6％(42/554)、40.5％(224/554)、8.1％ (45/554)、7.2％ (40/554)、5.6％(31/554),7种基因型约占总基因型的89.6％ (496/554)。深圳地区汉族人中NAT2基因主要等位基因为*4、*6、*7、*13,表型以快乙酰化型和中间型为主,分别占40.5％( 224/554)、46.7％(259/554),慢乙酰化型仅占12.8％(71/554)。用荧光定量PCR和直接测序法平行检测47名健康人NAT2基因,与直接测序法比较,检测282、341、481、590、857位点的敏感度分别为88.2％ (30/34)、87.5％( 7/8)、80.0％ (4/5)、100.0％ (22/22)、93.8％ (15/16),特异度分别为100.0％ (13/13)、94.9％ (37/39)、100.0％ (42/42)、96.0％( 24/25)、96.8％( 30/31),准确性分别为91.5％(43/47)、93.6％( 44/47)、97.6％( 46/47)、97.9％ (46/47)、95.7％ (45/47)。结论实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度、敏感度、特异度高,适用于临床及科学研究,深圳地区汉族人主要NAT2等位基因是*4、*6、*7,最常见慢乙酰化表型为*6/*7,这为与NAT2基因相关的代谢性疾病及肿瘤研究提供了数据。