cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术，研究cyclin E基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclin E mRNA设计siRNA序列，经PCR方法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物．以Lipofectamine^TM 42000脂质体法转染K562细胞，分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组，转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比，活细胞计数减少约80％，G1期细胞百分比增高30％，细胞基本停止增殖。干扰组cyclin E mRNA表达明显减弱，相对阴性对照组及空白对照组，干扰组mRNA表达下降70％。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclin E基因的表达，并进一步抑制细胞的生长，但对于干扰的长期有效性尚无实验结论，需通过长效表达载体实验验证．     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.     

辛伐他汀抑制K562细胞MAPK1、cyclin D1、E2F1、c-myc mRNA的表达

目的 探讨辛伐他汀抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡的分子机制. 方法 不同浓度辛伐他汀作用K562细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,RT-PCR测定MAPK1、cyclin D1、E2F1、c-myc mRNA表达.结果辛伐他汀能抑制K562细胞增殖,增殖抑制效应随药物浓度增加和作用时间延长而增大(P<0.05).与对照组比较,5、10、20 μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48 h和72 h后能明显增加细胞凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05),表明辛伐他汀能诱导K562细胞凋亡.10、20 μmol/L辛伐他汀处理K562细胞72 h后,MAPK1、cyclin D1、E2F1 c-myc mRNA表达水平明显降低. 结论 辛伐他汀可能通过调节Ras-MAPK途径抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制

目的应用小分子干扰RNA（siRNA）技术抑制survivin基因的表达,观察其对K562细胞化疗敏感性的影响,为临床白血病治疗提供理论依据。方法实验分为RNA干扰组、脂质体对照组、空白对照组。转染48h后用RT—PCR法,免疫组化法分别检测survivin在mRNA及蛋白水平的表达;MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素的药物浓度;免疫组化法检测K562细胞中3种耐药相关蛋白P—gP、TOPO-2、GST-π的表达。结果①RNA干扰组K562细胞的survivin基因表达水平明显下降;②RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性增高;③RNA干扰组K562细胞中阿霉素浓度增高;④RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达水平下降,而P-gP,TOPO-2的表达与对照组比较无显著差异。结论特异性siRNA能够有效抑制survivin基因的表达,并可能通过降低耐药蛋白GST-百的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。     

K562细胞survivin基因表达对淋巴细胞增殖和功能的影响

目的探讨K562细胞中survivin基因的表达对淋巴细胞增殖和功能的影响。方法将融合重组质粒pEGFP-C1-survivin和靶向survivin基因的RNAi的重组质粒pTZU6^＋1-survivin分别转染K562细胞,得到K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞,用G418筛选K562/survivin^＋细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法及免疫细胞化学法检测K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞中survivinmRNA及蛋白水平的表达,并与K562细胞作对照。将这3种细胞与健康人外周血单个核细胞（PBMC）混合培养（MLTC）,检测混合培养体系中淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性及培养上清中IFN-γ水平。结果K562/survivin^＋组的淋巴细胞增殖指数明显低于其余两组。survivin基因的表达水平与NK细胞活性呈负相关。混合培养上清中分泌的IFN-γ,K562/survivin＋组是K562组的1/4.5,是K562/survivin^-组的1/8。结论高表达的survivin可以抑制淋巴细胞的增殖、NK细胞活性及IFN-γ的分泌。     

Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

小干扰RNA对白血病细胞K562的生长和蛋白表达的影响

目的:检测小干扰RNA对慢性粒细胞白血病细胞系K562的影响。方法:脂质体转染细胞,MTT实验检测转染后的细胞活性,并绘制生长曲线,用Western blot检测p210蛋白表达水平的变化,并用Annexin-V-FITC法检测细胞凋亡水平。结果:与对照组相比,有2条小干扰RNA序列可以有效地降低细胞活性,诱导细胞凋亡并降低p210蛋白的表达水平。结论:小干扰RNA可抑制K562细胞活性,降低融合蛋白表达水平并诱导细胞,有望成为治疗慢性粒细胞白血病的有效方法。     

小檗碱对K562细胞生长的抑制作用

目的探讨小檗碱对Ｋ５６２细胞生长的抑制作用及对阿霉素（ＡＤＭ）耐药株Ｋ５６２／ＡＤＭ的影响。方法细胞抑制率和细胞生长曲线测定采用台盼蓝排染法，克隆形成实验采用半固体培养基培养，镜下计数。结果Ｋ５６２细胞经小檗碱处理后生长明显受抑，呈作用时间和剂量依赖性，ＩＣ５０为２７．２（２４ｈ），４．６９（４８ｈ），１．２２（７２ｈ）ｍｇ／Ｌ。细胞增殖速度显著降低，２０ｍｇ／Ｌ达完全抑制。克隆原细胞存活曲线呈指数型，可超过２个指数杀灭。小檗碱对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞有较强耐药性。结论小檗碱对Ｋ５６２细胞生长具有明显抑制作用，提示其可能作为抗肿瘤药。     

K562细胞7种珠蛋白基因 mRNA水平的研究

目的研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA,比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,B基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ,K562细胞不表达B-珠蛋白mRNA。结论转录后水平的调控可能在k562细胞α基因簇的表达中起重要作用,B基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。     

siRNA沉默细胞周期蛋白A2基因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的研究siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向cycllnA2基因的siRNA,用oligofectamine将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞（HSF）中,用无义siRNA转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照,实时-聚合酶链反应（PCR）、Western印迹方法检测cyclinA2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cycllnA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞PCNA及cyclinB1基因表达的改变。结果1、10、50、100nmol／L浓度的cyclinA2-siRNA分别使MG-63细胞cyclinA2基因表达降低了9．4％,56．4％,79．2％和84．3％,同时cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10nmol／L及50nmol／LsiRNA后48h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39．1％及54．9％,细胞周期阻滞于G0／G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）及cyclinB1的mRNA表达水平明显下降。对正常成纤维细胞HSF,50nmol／LcyclinA2-siRNA可抑制58．1％的cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对cyclinA2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclinA2mRNA及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向cyclinA2的siRNA有望成为治疗骨肉瘤的新途径。     

小分子干扰RNA分子化学修饰研究进展

RNA干扰是指转录后的基因沉默现象,可使基因沉默的小分子干扰RNA（siRNA）为基因治疗提供了又一个选择。为了实现其基因治疗价值,根据siRNA的作用机制和反义核酸修饰所取得的经验,为优化其药学性质和有效转运,进行了各种改进。其中,载体修饰和化学方法修饰siRNA是优化其性质的重要方法,本文对两种方法进行了简要的综述。     

长链非编码RNA PVT1沉默对K562细胞增殖的影响

目的 筛选靶向抑制长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)的小干扰RNA(siRNA),并探讨其对人白血病细胞株K562细胞增殖的影响.方法 针对PVT1设计合成PVT1-siRNA1、2、3、4序列及无关对照siRNA(SC-siRNA)序列.利用HiperFect转染试剂将各条siRNA转入K562细胞,实验依此分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组和SC-siRNA组,并设空转组和细胞组.转染后用实时定量RT-PCR检测细胞中PVT1 RNA的相对表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 转染24、48 h后siRNA4组PVT1 RNA水平下降,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01), 而siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组PVT1 RNA水平与细胞组相比差异无统计学意义(P>0.05);转染24、48、72 h后siRNA4组细胞增殖抑制率都增加,与SC-siRNA组和空转组相比差异均有统计学意义(P<0.01);转染48、72 h后siRNA4组出现了G1期阻滞,G1期细胞比例增加,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 PVT1-siRNA可通过阻滞细胞周期的进展而抑制K562细胞的增殖.     

SiRNA逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药耐药

目的:研究双链短干扰RNA(siRNA)对白血病多药耐药细胞模型(K562/NaB)肺耐药相关蛋白(LRP)表达及功能的影响.方法:针对LRP基因设计合成特异性siRNA,在脂质体介导下转染K562/NaB;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测K562细胞LRP mRNA的水平;用流式细胞术检测K562/NaB细胞LRP蛋白表达的变化和细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积;MTT法检测阿霉素(ADM)对K562/NaB细胞耐药的半数抑制浓度(IC50).结果:siRNA转染后:K562/NaB细胞的LRP mRMA水平明显降低;LRP蛋白表达由阳性转为阴性;细胞内DNR的蓄积明显增加,DNR平均荧光增强3.28倍;对ADM药物敏感相对逆转效率为78.18%.结论:siRNA可逆转由LRP介导的白血病细胞多药耐药.     

siRNA对K562和K562/ADM细胞耐药和凋亡的调节

目的 研究联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,对白血病细胞株K562和耐药的K562/ADM细胞药物敏感性和凋亡的影响.方法 体外化学合成以多药耐药相关蛋白(MRP)和bcl-2为靶标的siRNA,分别或联合用脂质体转染人阿霉素处理的K562和K562/ADM以单纯化疗处理组和未处理组为对照.转染后24、48、72 h,MTT法检测各组细胞生长抑制率,计算IC50值.转染24 h后RT-PCR检测各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,48 h后流式细胞仪检测细胞MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率.结果 K562/ADM细胞ADM的IC50为12.81 μg/ml,ADM MRP-siRNA组降为3.74 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为6.82 μg/ml ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA组降至2.51 μg/ml;K562细胞ADM的IC50为6.75 μg/dml,ADM MRP-siRNA组降为3.22 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为3.56 μg/ml,ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA降至1.84 μg/ml,有统计学意义(P<0.01).转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA后,细胞相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞凋亡率显著升高,联合转染两种siRNA,细胞的IC50进一步下降,细胞凋亡率进一步升高,与分别转染组相比有统计学差异(P<0.05);结论联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率.     

bcl-2 shRNA表达载体的构建及其在K562细胞中的干扰作用研究

目的构建bcl-2shRNA表达载体，观察其在人白血病K562细胞系中对bcl-2基因的干扰作用。方法设计合成有短发夹结构靶位bcl-2基因的65个碱基的寡核苷酸，连接到载体pSIREN-Shuttle（pSS），构建了bcl-2shRNA表达载体，得到重组质粒pSS-shbcl-2-1、pSS-shbcl-2-2、pSS-shbcl-2-3和一个阴性对照，将其稳定转染K562细胞，分别用RT-PCR、Western-blot法检测转染后K562细胞bcl-2mRNA及蛋白质表达水平。结果成功构建了bcl-2shRNA的表达载体，并筛选到转染后K562细胞在pSS-shbcl-2-3组bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达水平明显抑制。结论特异性的bcl-2shRMA可以干扰K562细胞中bcl-2基因的表达，针对bcl-2基因不同位点的不同shRNA也有干扰效果的差异。