人G250真核表达载体pIRES-neo-G250的构建及表达

目的构建包含人的G250真核表达载体,并将该载体转导入293 T细胞检测其表达,为构建以G250为靶点的肾癌模型提供研究基础。方法通过聚合酶链反应获得G250基因,将其连接至PMD18T过渡载体,然后克隆到载体pIRES-neo中。把构建后的重组质粒pIRES-neo-G250转染到293 T细胞,用流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测其表达。结果 PCR扩增出的G250基因测序正确,酶切鉴定重组质粒pIRES-neo-G250正确,说明质粒构建成功;流式细胞术、免疫荧光和RT-PCT检测结果表明,重组质粒pIRES-neo-G250在293 T细胞中得到表达。结论该实验成功构建了重组质粒pIRES-neo-G250,并且在293T细胞中能够有效表达,为后续构建转染人G250的基因细胞株工作奠定了基础。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒并建立人肺腺癌细胞株A549的稳定表达株.方法 采用RT-PCR法从正常人支气管上皮细胞株HBE135-E6E7中克隆得到PSMA7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接.双酶切和测序鉴定后,再将PSMA7片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上.构建好的pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入A549细胞株中,经CA18筛选,得到阳性克隆细胞株,再用RT-PCR及Westem blotting法检测转染后PS-MA7的mRNA及蛋白表达水平.结果 pcDNA3.1(-)/PSMA7质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实.目的 基因PSMA7的序列完全正确,真核表达质粒构建成功.RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的PSMA7 mRNA表达水平(2.698±0.661)明显高于未转染组(1.243±0.176)和转染pcDNA3.1(-)组(1.198±0.514,P<0.05),后两者间无明显差异.Western blotting检测同样显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的蛋白表达水平(1.978±0.661)明显高于未转染组(0.891±0.234)和转染pcDNA3.1(-)组(0.782±0.375,P<0.05),后两组间亦无明显差异.结论 成功构建了PSMA7基因的真核表达质粒,并建立了稳定表达PSMA7的A549细胞株,为后续研究奠定了基础.     

PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

HA表位标记的人Axud1基因的构建及在肺腺癌SPC-A1细胞中的表达

构建在哺乳动物细胞中表达的血凝素HA表位标记的人Axud1融合蛋白表达载体。RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增Axud1全长cDNA ,用含HA序列的特异引物PCR扩增HA Axud1,经BamHⅠ、XbaⅠ酶切后插入到经BamHⅠ、XbaⅠ酶切的真核表达载体pcDNA3 .1( ) 中 ,重组质粒PCR、酶切和测序鉴定正确 ,最后将该质粒转染入肺腺癌SPC A1细胞中 ,Westernblot检测HA Axud1融合蛋白的表达。结果显示 ,筛选的G418抗性克隆SPC A1细胞中均有HA Axud1融合蛋白的表达 ,为进一步研究Axud1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了一个重要工具     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2δEGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法 以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达.结果 测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光.应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.     

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的构建与鉴定

目的:为适应恶性肿瘤免疫治疗中多基因联合应用的需要,在真核表达载体pVAX1的基础上,利用内部核糖体进入位点IRES序列,构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES,以增强DNA疫苗的免疫疗效.方法:通过PCR扩增获得目的基因IRES并定向克隆到pVAX1载体中,然后在IRES序列的上下游分别插入红色荧光蛋白基因DsRed1和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,瞬时转染人胚胎肾细胞293T,通过流式细胞术和免疫荧光验证基因表达.结果:pVAX1-IRES经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致,DsRed1基因和EGFP基因在pVAX1-IRES载体中,不仅可以分别表达,而且可以同时表达,显示该双顺反子真核表达载体构建成功.结论:pVAX1-IRES双顺反子表达载体的构建,为基因联合表达和恶性肿瘤的免疫治疗作了必要准备.     

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。     

大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察

目的构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果。方法采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,采用荧光纤维镜观察转染效率,BrdUELISA法检测转染后细胞增殖情况并作为其干扰效果的初步筛选,定量PCR、免疫组化法检测c-ski基因和蛋白的表达变化。结果构建3个c-SkisiRNA沉默质粒,按照质粒(μg)/脂质体(μl)1∶2.5的比例转染时效率最高,约为53.5%。转染c-SkisiRNA沉默质粒后,细胞增殖降低,且抑制效果与转染剂量成正比。定量PCR、免疫组化法结果显示转染后c-ski基因表达下调51%(P<0.01),蛋白表达明显降低。结论c-Ski沉默质粒构建成功,瞬时转染大鼠皮肤原代成纤维细胞后可以显著抑制c-ski基因和蛋白的表达。     

IL-8基因真核表达载体的构建及其在OVCAR-3卵巢癌细胞中的表达

目的:构建白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)基因真核表达载体,瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞,为进一步探讨其与肿瘤发生发展关系奠定基础.方法:采用RT-PCR法自健康志愿者外周血单个核细胞扩增IL-8基因,构建pcDNA3.1( )/IL-8重组质粒;脂质体介导将外源基因转入OVCAR-3卵巢癌细胞,半定量RT-PCR、Western印迹及ELISA法鉴定其mRNA及蛋白瞬时表达后,MTT法检测细胞转染前后生长增殖特性的改变,FCM检测细胞周期的变化.结果:重组质粒双酶切电泳结果显示,相应位置(300 bp,5 400 bp)可见2条清晰特异的DNA条带;DNA测序结果进一步显示,重组质粒中插入的基因片段全长 300 bp,编码序列与GenBank报道的基因序列相符,阅读框保持不变;RT-PCR、Western 印迹检测及ELISA检测结果显示,转染后OVCAR-3细胞IL-8 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);MTT检测结果显示,IL-8转染细胞组转染3 d后的光密度值(D值)显著高于未转染细胞组(P<0.05);FCM分析结果显示,OVCAR-3细胞转染IL-8基因后进入S期的细胞比例显著增高,增殖指数也相应上升,与未转染及空质粒转染组细胞相比,差异显著(P<0.05).结论:IL-8基因真核表达载体成功构建并瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞;IL-8可以自分泌方式促进卵巢癌OVCAR-3细胞生长增殖.