腺病毒载体HIV疫苗在C57BL/6小鼠体内的生物分布评价

目的:建立腺病毒载体HIV疫苗检测的实时荧光定量PCR方法,并评价疫苗在C57BL/6小鼠体内的生物分布。方法:以gag基因片段为检测对象,建立绝对定量PCR方法。C57BL/6小鼠单次肌内注射5×109vp HIV疫苗,给药后d 3,15,30,60,85收集组织脏器,用建立的荧光定量PCR方法定量检测HIV疫苗。结果:检测方法线性范围为1×102～1×107copies.μL-1,特异性强,重复性较好。HIV疫苗主要分布在注射位点,淋巴结、脾脏和肝脏也有少量分布;疫苗的量随时间延长逐渐减少。结论:肌内注射HIV疫苗后导致广泛的分布,分布的量呈时间依赖性减少,没有生殖细胞转移的危险,HIV疫苗在小鼠体内是安全的。     

DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗小鼠体内生物分布研究

目的考察DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗在小鼠体内生物分布情况。方法采用定量PCR方法分别对复合疫苗免疫后DNA疫苗的分布情况以及复合疫苗组分HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后的生物分布情况进行测定。结果复合疫苗免疫后5d和30d,主要是在注射部位检测到质粒DNA残留,在免疫后第56d,各脏器均未检测到质粒DNA残留。HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后第5d,仅在给药部位检测到DNA残留,免疫后第36d,各脏器均未检测到DNA残留。结论复合疫苗免疫机体后短期只在注射部位分布,且随时间延长减少至消失,不会长期在机体内存留。     

HSV-1基因转移载体在荷瘤裸鼠体内的生物分布研究

目的 研究HSV-1基因转移栽体在BALB/c荷瘤裸鼠体内的生物分布.方法 BALB/c裸鼠注射人乳腺癌MCF-7细胞制备肿瘤模型,瘤体内注射1×107pfu HSV-1,每2天给药1次,共给药3次.分别于给药后24h、5d和17d采集组织脏器,采用Taqman实时荧光定量PCR法,检测不同组织脏器中HSV-1基因拷贝数.结果 成功制备裸鼠肿瘤模型.在不同时间点,肿瘤中检测到的病毒载体最多,且随着时间延长不断增加;淋巴结、背根神经节和性腺中也有较高水平的病毒载体;其他组织器官中病毒载体量较少.结论 HSV-1能为基因转移提供有效、安全的载体平台,并能用于构建溶瘤基因治疗产品.     

重组腺病毒TOA02在荷瘤裸小鼠体内的生物分布研究

目的:研究重组腺病毒TOA02在荷瘤裸小鼠体内的生物分布。方法:皮下接种人肺癌细胞系A549建立荷瘤裸小鼠模型,分为对照组(生理氯化钠溶液,n=6)和实验组(3×1010copies/ml TOA02,n=18),每只小鼠瘤内注射给药50μl,隔日注射1次,共3次。首次给药后第11、18、36天取小鼠体内肿瘤和血液、睾丸/子宫、附睾/卵巢、脾、肾、肝、肺、心脏、骨髓、大脑,每个时间点6只,用定量聚合酶链式反应法检测各肿瘤、血液和组织脏器中TOA02的腺病毒壳粒六邻体(Hexon)DNA copies。结果:对照组荷瘤裸小鼠体内各肿瘤、血液和组织脏器中均未检出TOA02的Hexon DNA copies。实验组荷瘤裸小鼠各时间点睾丸/子宫、附睾/卵巢、骨髓、大脑中均未检出TOA02的Hexon DNA copies;其中第11天肿瘤内TOA02的Hexon DNA copies[(2 240 541±1 692)copies/100μg genome DNA]均明显高于血液和其他组织脏器;第18天肿瘤的Hexon DNA copies最高[(13 120 285±88 210)copies/100μg genome DNA],在组织脏器内的分布量依次为肝>肾>脾>肺>心脏;第36天时除肿瘤内尚能检出Hexon DNA copies[(336 453±23 415)copies/100μg genome DNA]外,血液和其他脏器均未检出。结论:瘤内注射TOA02可在肿瘤内大量增殖,并播散入肝、肾、脾、肺、心脏等血流丰富的脏器,但各脏器组织中的病毒体会逐渐被清除。     

狂犬病病毒用作HIV疫苗的载体

美国 Jefferson医学院的研究人员运用减毒的狂犬病病毒作为表达人类免疫缺陷症病毒 (HIV)包膜蛋白的载体 ,研制 HIV疫苗。这是一种新方法 ,因为狂犬病病毒或不分节段的负链 RNA病毒用于 HIV疫苗尚属首次。　　研究人员将 HIV- 1 gp1 6 0基因插入减毒的狂犬病病毒产生重组病毒。然后将其注射小鼠 ,并加强注射一次 HIV gp1 2 0蛋白以致敏免疫系统。结果该病毒成功地表达出 gp1 6 0糖蛋白 ,并诱导强的抗 HIV- 1包膜蛋白的体液免疫应答。另外 ,在小鼠血清中检出滴度高达 1 :80 0的抗 HIV中和抗体。而一些广泛使用的重组病毒载体 (表达…     

腺病毒载体疫苗在恒河猴体内的长期毒性试验

目的探讨以5型腺病毒为载体的人用疫苗Ad5-LMP2在恒河猴体内的药效学作用和安全性。方法恒河猴经im给予4.5×1011、1.5×1011和0.5×1011v.p·(kg·次)-1的Ad5-LMP2和等体积的磷酸盐缓冲液(对照组),每5d给药1次,共给药6次。在停药次日和停药15d时进行尿常规、血液、眼科、心电图、脏器重量和系数、大体观和病理组织学检查;给药前后定期采取猴血清并从剖检猴的脾脏分离淋巴细胞,用ELISA、病毒中和试验和ELISPOT检测腺病毒载体和目的基因蛋白产物LMP2诱导的体液和细胞免疫应答;通过PCR扩增各器官总DNA中的lmp2基因来检测Ad5-LMP2在体内的生物分布。结果在整个试验期间试验猴均未出现任何异常反应,也无动物死亡;给药组动物在整个给药期间的摄食、饮水和体重增长及上述各项常规毒理学检测中均未出现明显异常。受试物在试验猴体内诱发了较高水平的抗腺病毒中和抗体,但目的蛋白LMP2诱导的特异性细胞免疫应答未受抗腺病毒中和抗体的明显抑制;在猴的心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸(或卵巢)及给药部位均可检测到Ad5-LMP2并维持到停药后15d。结论在保证受试物药理学作用的前提下,恒河猴连续1mon肌肉注射相当人临床拟用剂量37.5倍的Ad5-LMP2,未见明显不良反应,中毒靶器官和中毒剂量未明显显示,其安全剂量大于4.5×1011v.p·(kg·次)-1。     

HMGB1对HPV16型重组腺病毒载体疫苗免疫效果的影响及机制研究

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分子与人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7重组腺病毒载体疫苗免疫效果的关系及机制。方法 通过TC-1细胞移植诱导建立小鼠肿瘤模型,在接种HPV重组腺病毒载体疫苗的同时,给与HMGB1特异性拮抗剂HMGB1 A box注射,开展肿瘤抑制试验、小鼠免疫状态观察、肿瘤相关信号检测等研究。结果 A box蛋白与疫苗联用,即可显著降低模型小鼠HMGB1血清水平,抑制肿瘤组织中NF-kB的mRNA高表达,提高疫苗的抗肿瘤活性。同时,它还可减少IL-4、促进IFN-g产生,使体内免疫平衡由Th2向Th1偏移。虽然A box对于Bax的影响并不显著,但在接种疫苗并注射A box蛋白后,由肿瘤引起的NF-kB、Bcl-2、c-IAP2、VEGF、MMP-9的表达提高、Bax表达降低均得到显著扭转。结论 HMGB1分子可以削弱HPV重组腺病毒载体疫苗的免疫效果,其机制可能是HMGB1在调节免疫平衡状态及控制肿瘤细胞的凋亡、浸润、转移等多层面均能参与并发挥重要作用。     

病毒载体疫苗非临床生物分布研究的关键点

目的总结病毒载体疫苗非临床生物分布研究的关键点,提高疫苗生物分布研究水平。方法依据文献、指导原则和实验室经验,分析实时荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）和取材组织选择、取材时间点设定以及交叉污染预防措施等动物实验设计环节的关键质量控制点。结果生物分布研究应采用实时荧光定量PCR技术,并对核苷酸序列、扩增反应特异性、灵敏度、抑制因子及反应条件进行验证。对于动物实验部分,各时间点、各组及不同性别一般3～5只动物;给药途径、制剂和剂量应和预期临床应用一致;在给药后数天至数月的不同时间点进行组织取材;采取有效的方法预防组织间交叉污染。结论研究过程中的每个环节都会影响生物分布研究的结果 ,要采取相应的措施对研究过程中的关键环节进行质量控制,同时应尽快制定详细的具有指导意义的生物分布研究指导原则和标准。     

双黄连片对小鼠流感病毒和腺病毒感染的保护作用

目的观察双黄连片在实验动物体内抗流感病毒和腺病毒的作用,为临床用药提供试验依据。方法建立流感病毒鼠肺适应株FM1感染小鼠模型和腺病毒ADV3株感染小鼠模型,分别灌胃给予高、中、低剂量双黄连片,设立病毒唑对照和正常对照组,观察各组小鼠的死亡数、测定小鼠存活时间、肺指数和肺组织流感病毒滴度。结果双黄连片可明显降低流感病毒和腺病毒感染小鼠的死亡率,延长肺炎小鼠的存活时间,降低肺炎小鼠的肺指数;同时,双黄连片还能降低肺组织中流感病毒的滴度。结论双黄连片在小鼠体内有明显抑制流感病毒和腺病毒的作用。     

汉滩病毒核酸疫苗滴鼻免疫小鼠表达动力学研究

目的 构建汉滩病毒DNA疫苗，考查小鼠鼻内接种DNA疫苗后的基因组织定位及表达动力学，为进一步研究汉滩病毒DNA疫苗粘膜免疫的疗效作前期准备。方法 采用PCR法从PJSA1175-S质粒扩增汉滩病毒的S基因片段后装入PcDNA3．1B(-)载体，并以此候选DNA疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA和组织总RNA，用PCR及RT-PCR检测质粒的分布和表达动力学。结果 构建了汉滩病毒DNA疫苗PcDNA3．1B-S1.3。免疫接种该疫苗第1天后在小鼠鼻咽、肺、肾、肝、脾、小肠等组织中均有质粒分布；第1周内上述组织中均可检测到特异mRNA，第2周起小肠、肝及肾中特异mRNA消失。结论成功构建了PcD-NA3．1B-S1.3DNA疫苗，构建的疫苗滴鼻免疫后在小鼠体内得到广泛的分布及表达。     

在小鼠中比较复制缺陷型腺病毒与Nyvac痘病毒疫苗载体的效力

近年来,在重组活疫苗的研究中越来越多地将腺病毒和痘病毒用作重组疫苗载体.作者对以两者为载体构建的重组活疫苗免疫小鼠后的效力进行了比较.实验选用能引起小鼠致死性感染的伪狂犬病病毒(PRV)为攻击病毒,将能诱生中和抗体的PRV糖蛋白gD基因分别与复制缺陷型腺病毒和Nyvac痘病毒组建成重组疫苗Ad-gD和vP900.两种重组疫苗分别以不同剂量[10~(2.9)～10~(8.9)半数组织培养感染量     

EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果及分布研究

背景与目的 EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2是预防和治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原,本研究以食蟹猴为研究系统,观察携带EBV潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)在动物体内引起的细胞免疫应答及病毒载体分布。方法分别使用低、中、高不同剂量的Ad-LMP2,于0周、4周以肌内多点注射的方式免疫食蟹猴,应用流式细胞仪检测动物外周血CD3、CD4、CD8阳性T细胞的比值;γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γ-ELISPOT法)检测Ad-LMP2诱导的LMP2特异性CTL;RT-PCR方法检测首次和末次注射后,不同时间点外周血中重组病毒的载量,以及8周后,脑、心、肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢和注射局部肌肉的基因分布情况。结果与同期对照组或免疫前比较,Ad-LMP2免疫的动物外周血T淋巴细胞亚群未见差异(P>0.05);低、中、高不同剂量都能够诱导产生LMP2特异性CTL,其中,中、高剂量组反应水平较高;Ad-LMP2肌内注射后15min～1h在血中浓度最高,2～8h后分布到其他脏器。1d后,病毒主要分布在注射局部的肌肉组织中,而在脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢或睾丸等组织内,未检测到重组病毒。结论 Ad-LMP2在食蟹猴体内能够诱导产生LMP2特异性CTL,对T淋巴细胞亚群不产生影响,重组病毒只分布在注射局部肌肉,没有潜在危险。     

SARS疫苗动物试验

美国匹兹堡大学医学中心的研究人员研制出重组的严重急性呼吸道综合征( SARS)冠状病毒疫苗 ,并在动物模型中进行了试验。这一结果可能很快促成 SARS疫苗的人体试验。　　匹兹堡大学医学院和公共卫生研究院的科研人员与美国疾病控制和预防中心的合作研究表明 ,腺病毒载体疫苗能诱导 SARS-冠状病毒 ( SARS- Co V)特异性 T细胞和病毒中和抗体应答。本研究是首次公开报道的 SARS疫苗研制工作。　　研究人员将三种 SARS- Co V载体联合肌肉注射 6只恒河猴。另 2只恒河猴免疫相同剂量的空腺病毒载体 ,作为对照。 2 8天后 ,动物接受第 2…     

裸DNA预防结核病

目前,所谓的“裸DNA疫苗”保护动物免受流感、疱疹、人类免疫缺陷症病毒（HIV）、乙型肝炎甚至变态反应的攻击已获成功。但这种技术的真正前景在于研制一些用活病原体制备危险性太大的有效疫苗（如HIV和肝炎）。 现在,研究人员又取得了一项引人瞩目的成就——结核病裸DNA疫苗。Merck研究实验室和英国国立医学研究所的研究人员分别用编码结核杆菌单个抗原的裸质粒基因保护小鼠免受结核病侵袭。英国研究组给小鼠注射编码结核杆菌热休克蛋白hsp65的质粒DNA载体,而Merck研究组使用编码结核杆菌抗原的基因。     

重组人干扰素α-2b纳米粒小鼠体内药物动力学及组织分布

目的考察小鼠静脉注射重组人干扰素α2b纳米粒后的体内药动学及组织分布。方法小鼠尾静脉注射给药后,采集不同时间血液、肝、肺和肾样品,经处理后,应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定重组人干扰素α2b的血浆及组织中浓度。结果重组人干扰素α2b纳米粒及溶液注射给药,血浆药时数据经3p97药动学程序拟合,均符合一级消除动力学双隔室模型。给予重组人干扰素α2b纳米粒小鼠体内消除半衰期(t1/2β=2.786 h)是溶液剂消除半衰期的(t1/2β=0.599 h)的4.7倍;血药浓度时间曲线下面积纳米粒组是溶液剂组的3.95倍,肝组织中药时曲线下面积纳米粒制剂是溶液剂组的3.8倍。与溶液剂组相比,纳米粒组在肺、肾中的药物分布也显著增加(P<0.001)。结论纳米粒作为重组人干扰素α2b的载体,能够显著延长重组人干扰素α2b小鼠体内消除半衰期,增加其在肝、肺、肾组织中的分布。     

Invacc疫苗平台显现有希望的结果

丹麦哥本哈根大学的Pravsgaard等研发了一种新型疫苗,希望能使疫苗使用得到彻底改革。Invacc疫苗平台技术主要围绕连接于病毒基因的短氨基酸链,而短氨基酸链所连接的病毒则是疫苗试图预防的病毒。将连有短氨基酸链的病毒基因插入一种灭活病毒,如腺病毒,然后用这种灭活病毒注射接种对象。在小鼠中进行的新型疫苗检测取得了令人鼓舞的结果,新型疫苗接种小鼠能100％抵抗各种致死性流感病毒毒株的攻击。     

腺病毒-呼肠孤病毒杂交疫苗载体

研究者开发了一种新型杂交病毒载体 ,它是使腺病毒带有人呼肠孤病毒附着蛋白。　　腺病毒是常用的载体 ,用于体内基因转移、基因治疗和疫苗。疫苗应用原理是使宿主细胞合成病原体抗原蛋白拷贝。这能为免疫系统提供长久而有效的刺激 ,从而产生抗天然病原体的强烈免疫。然而 ,腺病毒是经某些受体进入宿主细胞 ,而这些受体不可能存在于所有类型的细胞上。尤其是粘膜组织中的大多数免疫细胞不带有腺病毒受体。　　呼肠孤病毒具有附着蛋白 σ- 1 ,这就给了此病毒进入树突状细胞 ( DC)和其他免疫细胞的钥匙 ,这些免疫细胞对腺病毒是关闭的 ,而且…     

Research on expression of IFN-γ in laryngeal tissues of mice via IFN-γ gene transfected BMSCs by using recombinant adenoviruses Ad5-IFN-γ-GFP

目的 探讨干扰素-γ(IFN-γ)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)对喉部疾病的治疗效果.方法 采用Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒,将转染IFN-γ的BMSCs注射到小鼠喉旁组织,第1、3、7、14、28天取骨髓和喉旁组织用Western blot检测IFN-γ蛋白表达水平.结果 当MOI=100和转染时间72 h时,细胞上清液IFN-γ表达水平分别达到峰值.注射空白培养液和空白mBMSC的骨髓和喉旁组织IFN-γ基本不表达.注射病毒转染的mBMSC后,骨髓和喉旁组织中都开始大量表达IFN-γ,且表达量随注射时间延长而增加.结论 IFN-γ导入BMSCs并通过小鼠喉旁局部注射,可以在组织获得持久表达.为临床IFN-γ基因治疗喉部肿瘤提供了动物实验依据.     

Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞对小鼠喉旁组织IFN-γ蛋白表达的实验研究

目的探讨干扰素-γ（IFN-γ）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）对喉部疾病的治疗效果。方法采用Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒,将转染IFN-γ的BMSCs注射到小鼠喉旁组织,第1、3、7、14、28天取骨髓和喉旁组织用Western blot检测IFN-γ蛋白表达水平。结果当MOI=100和转染时间72h时,细胞上清液IFN-γ表达水平分别达到峰值。注射空白培养液和空白mBMSC的骨髓和喉旁组织IFN-γ基本不表达。注射病毒转染的mBMSC后,骨髓和喉旁组织中都开始大量表达IFN-γ,且表达量随注射时间延长而增加。结论IFN-γ导入BMSCs并通过小鼠喉旁局部注射,可以在组织获得持久表达。为临床IFN-γ基因治疗喉部肿瘤提供了动物实验依据。     

人干扰素注射人体和动物后在器官和组织中的分布情况

[et al:5:594,1980(俄文)] 本文研究人干扰素经不同途径注射动物和人体后,在器官和组织(特别是骨髓)中的分布情况。给小鼠和家兔肌肉注射10~6U/kg干扰素后,测定血清、骨髓、淋巴结和肾脏内的干扰素。发现注射干扰素后2小时,在小鼠血