PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

siRNA真核表达载体对大鼠耳蜗前体细胞Notch3基因表达的影响

目的 构建Notch3基因的siRNA真核表达载体,探讨其对大鼠耳蜗前体细胞中Notch3基因表达的影响.方法 机械分离并胰酶消化新生大鼠耳蜗感觉上皮,悬浮培养基培养耳蜗前体细胞.根据Notch3基因序列设计并合成2对siRNA,插入pSilencer4.1-CMV neo载体,进行酶切及测序鉴定.采用脂质体法向大鼠耳蜗前体细胞转染重组质粒,采用Real time-PCR和Western blotting法检测重组质粒对Notch3基因的干扰效果.结果 经前体细胞标记物Abcg2染色鉴定证实原代培养的细胞球为耳蜗前体细胞.酶切及测序鉴定证实成功构建了siRNA真核表达载体pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2. Real-time PCR和Western blotting检测结果显示所构建的Notch3基因真核表达载体成功地干扰了目的基因的表达.与空白对照组比较,转染pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2的细胞Notch 3 mRNA和蛋白表达量均有明显减少,而转染空质粒的细胞与空白对照组比较无显著差异.结论 成功构建了大鼠Notch3基因的RNAi真核表达载体,该载体在大鼠耳蜗前体细胞中对Notch3基因的表达可发挥抑制作用.     

阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2δEGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法 以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达.结果 测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光.应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.     

乙型肝炎病毒X蛋白上调S100钙结合蛋白A11基因启动子表达活性研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBV-X蛋白)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以解放军第302医院基因治疗研究中心自行构建的HBV-X蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)技术的筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-p),聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-S100-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 pCAT3-S100-p在HepG2细胞中能够指导CAT的表达;共转染实验中pCAT3-S100-p pcDNA3．1(-)-X组CAT的表达活性是pCAT3-S100-p的2．1倍。结论 所克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性作用;HBV的X蛋白具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了解放军第302医院基因治疗研究中心利用SSH技术及基因表达谱技术研究HBV-X蛋白反式激活作用的结果。     

DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的 构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系.方法 以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切以及测序验证重组质粒的正确性.将重组质粒以Lipo-fectamine~(KM) 2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达.结果 双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明EC-SIGN基因与原序列一致.pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了急定表达DC-SIGN分子的细胞系.流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%.免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面.Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带.结论 成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

pIRES2-EGFP-hBMP2载体在人骨髓基质细胞中的表达及意义

目的：研究人骨形成蛋白hBMP2真核表达载体pIRKS2-EGFP-hBMP2在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达及意义。方法：利用DNA重组技术，将hBMP2片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中；EeoRI/BamHI双酶切鉴定；脂质体介导的方法转染HFCL．细胞；荧光显微镜下观察转染细胞；免疫组化染色检测hBMP2基因的表达。结果：经酶切鉴定显示，成功地构建了重组载体pIRES2-EGFP-hBMP2。转染HFCL 48h后在荧光显微镜下观察到转染的HFCL细胞发绿色荧光。免疫组化染色显示转染hBMP2基因的HFCL细胞浆内有细的棕色颗粒，而转染空载体的HFCL细胞免疫组化呈阴性。结论：所构建的pIRES2-EGFP-hBMP2真核表达载体在HFCL细胞中有良好的表达，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对放射和化疗所致的造血和骨微环境破坏的改善奠定了基础。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

氧浓度非敏感性低氧诱导因子-1α表达载体的构建及其在PC12细胞系中的表达

目的 构建大鼠非氧浓度敏感性低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达载体并观察其在PC12细胞系中的表达. 方法 应用RT-PCR从脊髓损伤区域的细胞总RNA中扩增HIF-1αcDNA,采用重叠延伸PCR的方法克隆获得缺失氧敏感性降解结构域(ODD)的HIF-1α突变体基因克隆,采用质粒_pEGFP-C1构建重组真核融合表达载体,将其转入培养的PC12神经细胞系中,应用所融合的绿色荧光蛋白的表达和Western blot鉴定其在细胞内的表达. 结果 通过重叠延伸PCR的方法成功扩增得到非氧浓度敏感性的HIF-1α突变体基因(HIF-1α△ODD)序列,并构建了过量表达缺失ODD的转录调控因子HIF-1α突变体的重组表达质粒()pEGFPC1-HIF-1α△ODD).将其转染PCI2细胞系后,Western blot和绿色荧光蛋白结果均表明HIF-1α△AODD蛋白能在PC12神经细胞系中正确表达. 结论 成功构建了_pEGFPC1-HIF-1α△ODD真核表达载体并在PC12细胞系中观察到融合蛋白表达.     

大鼠糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及功能研究

目的：构建大鼠糖皮质激素受体变异体表达载体，研究其表达和功能。方法：运用RT—nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD结构域的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP—N2质粒载体，测序筛选重组质粒；荧光显微镜观察重组质粒转染后的表达情况；相对荧光素酶法检测转录激活活性。结果：扩增出长1612bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞转录激活活性增强。结论：成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体，该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。     

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的 构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

非编码基因MEG3稳定表达细胞株建立及其对p53转录活性的影响

目的构建人类长链非编码RNA母系表达基因3（MEG3）的真核表达载体,筛选MEG3稳定高表达的肝癌细胞株,分析MEG3过表达对p53转录活性的影响。方法根据GenBank中MEG3的基因序列设计合成特异引物,从肝癌细胞中扩增MEG3的cDNA序列,将其构建入pcDNA3.0真核表达载体中,得到pcDNA3.0-MEG3表达载体,转染肝癌细胞SK-Hep-1,用G418筛选稳定株,采用RT-PCR技术检测转染细胞中MEG3基因表达,采用荧光素酶报告基因技术分析MEG3过表达细胞中对p53介导的基因转录活性的影响。结果成功构建了MEG3真核表达质粒pcDNA3.0-MEG3,筛选获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,双荧光报告实验结果显示MEG3过表达能增强p53介导的转录激活作用。结论本研究获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,为深入分析MEG3的功能及其作用机制奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。