miR-27a下调肾癌细胞FOXO1表达并促进其细胞增殖

目的：探讨microRNA-27a（miR-27a）在肾癌细胞中的作用及调控机制。方法：应用miR-27a反义寡核苷酸（ASO）在体外转染786-O和Caki-1细胞;qRT-PCR法检测miR-27a及FOXO1 mRNA的表达情况,Western blot检测FOXO1蛋白的表达水平;CCK8检测miR-27a ASO对细胞增殖的影响。结果：786-O和Caki-1细胞中miR-27a表达高于HK2正常肾小管上皮细胞（P〈0.05）;利用miR-27a ASO抑制786-O和Caki-1细胞miR-27a表达后,发现两个细胞株FOXO1 mRNA和蛋白表达的升高及增殖能力的降低（P〈0.05）。结论：miR-27a可能通过调控FOXO1表达在肾癌中起致癌作用。miR-27a ASO可抑制肾癌细胞的增殖,因此miR-27a有可能作为肾癌基因治疗的候选靶点。     

FOXO1在肾癌组织和细胞中的表达及临床意义

目的:探讨FOXO1在肾癌组织和细胞中的表达及其与肾癌发生发展的关系。方法:实时定量PCR和Western blot检测肾癌细胞中FOXO1 mRNA和蛋白的表达情况;免疫组化方法检测肾癌组织中FOXO1蛋白的表达;应用针对人FOXO1基因的小干扰RNA在体外转染769-P细胞;CCK8检测细胞增殖情况。结果:免疫组化结果显示透明细胞肾癌和乳头状细胞肾癌FOXO1的阳性率低于嫌色细胞肾癌（P＜0.05）;FOXO1蛋白的表达与透明细胞肾癌的分期、分级有关（P＜0.05）;769-P细胞FOXO1 mRNA和蛋白表达水平高于786-O和Caki-1细胞;利用特异性的siRNA抑制FOXO1 mRNA和蛋白表达后,发现769-P细胞的增殖加快。结论:FOXO1表达下降与肾癌的分型和透明细胞肾癌的分期、分级有关,FOXO1可作为肾癌诊断和预后的标志物及治疗的靶点。     

姜黄素诱导激活FOXO3a促进肾透明细胞癌细胞的增殖抑制和细胞凋亡

目的:研究姜黄素(curcumin)对人肾透明细胞癌（clear-cell renal cell carcinoma,ccRCC）细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,及叉头框蛋白O3a（Forkhead box protein O3a,FOXO3a）在姜黄素抗肿瘤效应中发挥的关键作用。方法:MTT法用于检测姜黄素对ccRCC细胞活力的抑制作用;Annexin V/PI双染实验检测姜黄素对ccRCC细胞的诱导凋亡作用;免疫印迹法（Western blot,WB）检测姜黄素对FOXO3a、p-FOXO3a及下游BIM表达的影响,和凋亡蛋白caspase 3的激活情况。实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测FOXO3a转录水平。小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术用于沉默ccRCC细胞系中FOXO3a的表达。结果:通过对6种ccRCC细胞系（ACHN、786-O、769-P、A-498、Caki-1及Caki-2）FOXO3a蛋白基础表达水平进行检测,选取FOXO3a表达较高的786-O细胞系为研究对象。0~160 μmol/L姜黄素处理786-O细胞24 h和48 h后,呈时间和浓度依赖性对细胞活力具有显著抑制作用;786-O细胞在0~80 μmol/L姜黄素处理24 h后,明显促进细胞凋亡水平,且伴随着凋亡相关蛋白caspase 3的激活。786-O细胞中,姜黄素抑制p-FOXO3a,促进FOXO3a活化,并上调下游BCL-2家族促凋亡蛋白BIM表达水平。在siRNA沉默FOXO3a蛋白表达后,姜黄素对786-O细胞的生长抑制和诱导凋亡作用被抑制。结论:姜黄素通过诱导激活FOXO3a,在ccRCC细胞上发挥生长抑制和诱导凋亡的抗肿瘤作用。     

TET1对肾癌786-O细胞增殖的影响及其相关机制

目的:应用小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)沉默TET1(ten-eleven translocation1)基因表达,探索其对人肾癌786-O细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用脂质体转染法将靶向TET1基因的TET1-siRNA转染人肾癌786-O细胞,实验设空白对照组、阴性对照组和干扰组(TET1-siRNA组)。分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1、SUZ12(suppressor of zeste12)、EZH2(enhancer of zestehomolog 2)和EED(embryonic ectoderm development)mRNA及其蛋白的表达;MTT法和克隆形成实验检测786-O细胞的增殖活性和克隆形成率;FCM检测786-O细胞周期。结果:与空白对照组比较,转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1 mRNA及其蛋白的表达水平分别下降了(85.13±0.03)%和(56.41±0.09)%,差异有统计学意义(P<0.05);786-O细胞的增殖受到抑制,克隆形成能力明显下降,G0/G1期细胞百分比明显增加(P<0.05);SUZ12 mRNA及其蛋白表达水平下调(P<0.05),EED和EZH2蛋白表达水平变化不明显(P>0.05)。结论:TET1-siRNA可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平,明显抑制786-O细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,其机制可能与TET1调控SUZ12的表达,影响其靶基因对PRC2(polycomb repressive complex 2)的招募有关。     

肾癌细胞增殖过程MACC1和c-MET调控机制的探讨

目的:探讨MACC1和c-MET与肾癌的相关性,明确两者之间调控关系及对肾癌Caki-1细胞增殖的影响。方法:应用荧光定量PCR检测67例肾癌及相应癌旁正常组织中MACC1和c-MET mRNA的表达。设计并合成MACC1基因特异性的siRNA,转染肾癌Caki-1细胞,检测转染后MACC1和c-MET蛋白的表达以及Ca-ki-1细胞的细胞抑制率。结果:肾癌组织中的MACC1和c-MET mRNA表达较癌旁正常组织中均有明显增加(P<0.05),且两者呈正相关。siRNA-MACC1能够明显抑制Caki-1细胞中MACC1蛋白的表达,P<0.05。MACC1蛋白表达抑制的Caki-1细胞中c-MET蛋白的表达亦降低(P<0.05),细胞抑制率明显升高,P<0.05。结论:MACC1和c-MET都与肾癌相关,MACC1能够调节下游基因c-MET的表达,影响肾癌细胞的增殖能力,发挥促进肿瘤生长的作用。     

mir-27a、mir-200c及mir-145对肾癌细胞侵袭能力的影响

目的:探讨microRNA的表达在两种人肾癌细胞侵袭能力中的差异,为研究肾癌转移机制提供线索。方法:Transwell小室法检测两种人肾透明细胞癌细胞786-0、Caki-1侵袭能力差异。Real-time quantitativePCR方法检测两种细胞中mir-27a、mir-200c、mir-145表达水平。建立786-0及Caki-1细胞的裸鼠移植瘤模型,检测裸鼠786-0及Caki-1细胞移植瘤中mir-27a、mir-200c、mir-145可能调控的相应下游细胞黏附分子CD44、E-cadherin、β-catenin表达水平。结果:786-0细胞穿过Transwell小室的微孔膜的细胞数(196.8±4.9)明显高于Caki-1细胞(166.8±7.1)。786-0细胞中mir-27a、mir-200c、mir-145表达较Caki-1细胞明显升高。观察8周,786-0及Caki-1细胞在5×106/只的细胞数量下成瘤率为100%。CD44在裸鼠786-0细胞移植瘤中表达明显高于裸鼠Caki-1细胞移植瘤,β-catenin、E-cadherin在两种细胞裸鼠移植瘤中表达无明显差异。结论:mir-27a可能通过影响下游细胞黏附分子CD44的表达,影响肾癌细胞的侵袭能力,而mir-200c和mir-145影响肾癌侵袭能力的途径尚有待研究。     

小分子RNA干扰Notch1基因对肾癌Caki-1细胞增殖的影响

目的：探讨Notch1在肾透明细胞癌株中的表达,采用短片段RNA（small interferhtg RNA,siRNA）干扰技术沉默肾透明细胞癌中Notch1的表达,并观察其对Caki-1增殖的影响。方法：体外培养人正常肾小管上皮细胞HK-2及人肾癌细胞786—0和Caki-1。实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测Notch1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测Notch1蛋白的含量。特异性Notch1 siRNA干扰肾癌Caki-1细胞,用Lipofectamine2000转染48h后,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分别检测其中Notch1 mRNA、蛋白的表达变化,CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果：Notch1在肾癌细胞株中的表达要明显高于正常肾小管上皮细胞,差异具有统计学意义（P〈0.05）。siRNA—Notch1干扰以后可以明显降低Caki-1细胞中Notch1 mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义（P〈0.05）,同时检测Caki-1细胞增殖能力也随之下降（P〈0.05）。结论：Notch1在肾癌透明细胞癌中高表达,下调Notch1信号通路可以抑制肾细胞癌Caki—1的增殖,调节肾癌的生长。     

MACC1基因与肾癌转移的相关性及其对细胞侵袭能力的影响

目的:探讨MACC1基因与肾癌转移的相关性,及其表达降低对肾癌细胞侵袭能力的影响。方法:应用荧光定量PCR检测原发未转移肾癌和原发伴转移肾癌组织中MACC1 mRNA的表达。设计并合成MACC1基因特异性的siRNA,转染肾癌Caki-1细胞,检测转染后MACC1蛋白的表达以及Caki-1细胞的侵袭能力。结果:原发伴转移肾癌组织中的MACC1 mRNA表达较原发未转移肾癌明显增加(P<0.05)。siRNA-MACC1能够明显抑制Caki-1细胞中MACC1蛋白的表达(P<0.05)。MACC1蛋白表达抑制的Caki-1细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论:MACC1基因与肾癌的转移相关,其表达抑制能够降低Caki-1细胞的侵袭能力。     

mir-27a、mir-200c及mir-145对肾癌细胞侵袭能力的影响

目的：探讨microRNA的表达在两种人肾癌细胞侵袭能力中的差异,为研究肾癌转移机制提供线索。方法：Transwell小室法检测两种人肾透明细胞癌细胞786-0、Caki-1侵袭能力差异。Real-time quantitativePCR方法检测两种细胞中mir-27a、mir-200c、mir-145表达水平。建立786-0及Caki-1细胞的裸鼠移植瘤模型,检测裸鼠786-0及Caki-1细胞移植瘤中mir-27a、mir-200c、mir-145可能调控的相应下游细胞黏附分子CD44、E-cadherin、β-catenin表达水平。结果：786-0细胞穿过Transwell小室的微孔膜的细胞数（196.8±4.9）明显高于Caki-1细胞（166.8±7.1）。786-0细胞中mir-27a、mir-200c、mir-145表达较Caki-1细胞明显升高。观察8周,786-0及Caki-1细胞在5×106/只的细胞数量下成瘤率为100%。CD44在裸鼠786-0细胞移植瘤中表达明显高于裸鼠Caki-1细胞移植瘤,β-catenin、E-cadherin在两种细胞裸鼠移植瘤中表达无明显差异。结论：mir-27a可能通过影响下游细胞黏附分子CD44的表达,影响肾癌细胞的侵袭能力,而mir-200c和mir-145影响肾癌侵袭能力的途径尚有待研究。     

干扰组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8对肾透明细胞癌786-O细胞增殖的影响

目的 细胞增殖是影响肾细胞癌进展的重要因素,本研究旨在探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8在调节肾透明细胞癌786-O细胞增殖中的作用.方法 将体外培养肾透明细胞癌786-O细胞随机分为空白对照组、空质粒组和SET8-shRNA组3组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组细胞的增殖能力;RT-PCR和蛋白质印迹法检测3组细胞Survivin和Caspase-3的表达水平,分析干扰SET8对肾透明细胞癌786-O细胞增殖及相关基因和蛋白表达的影响.结果 shRNA-SET8可成功抑制786-O细胞中SET8蛋白的表达.MTT检测结果显示,0、12、24、36和48 h SET8-shRNA组增殖抑制率分别为(10.97±2.68)%、(20.38±7.12)%、(25.03±7.60)%、(30.35±1.97)%和(31.33±1.04)%,SET8-shRNA组786-O细胞的增殖能力较空白对照组和空质粒组明显降低,P<0.05.RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示,SET8-shRNA组Survivin mRNA相对表达量为0.257±0.024,较空白对照组(1.046±0.041)和空质粒组(0.994±0.018)明显下降(P<0.05),其蛋白的相对表达量为0.834±0.072,较空白对照组(0.951±0.047)和空质粒组(1.203±0.092)明显下降,P<0.05;而Caspase-3 mRNA的相对表达量为0.921±0.072,较空白对照组(0.421±0.022)和空质粒组(0.439±0.007)明显上升(P<0.05),蛋白的相对表达量为1.188±0.022,较空白对照组(0.541±0.060)和空质粒组(0.617±0.028)明显上升,P<0.05.结论 干扰SET8可以有效抑制肾透明细胞癌786-O细胞SET8蛋白表达,从而抑制Survivin和上调Caspase-3的表达而抑制肾透明细胞癌786-O细胞增殖能力.     

miR-19a-3p 靶向细胞黏附分子2 阻断AKT通路抑制肾癌细胞786-O 的增殖和迁移

[摘要] 目的：探讨肾癌组织高表达的miR-19a-3p 靶向调控细胞黏附分子2（cell adhesion molecule 2,CADM2）并通过AKT信号通路影响肾癌细胞增殖和迁移的机制。方法：收集2012 年4 月至2017 年11 月苏州大学附属第一医院肾内科收治的42 例资料完整的肾癌患者手术切除的肾癌组织和癌旁组织标本。采用qPCR检测肾癌组织和786-O等4 种肾癌细胞系中miR-19a-3p 的表达水平,CCK-8、Transwell 和免疫荧光法检测miR-19a-3p 敲减对肾癌786-O 细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的影响,双荧光素酶报告基因验证miR-19a-3p 与CADM2 的靶向关系。采用Wb 检测miR-19a-3p 通过CADM2 对AKT信号通路的调控作用。结果：miR-19a-3p 在肾癌组织及细胞系中均高表达（均P<0.01）。敲减miR-19a-3p 可显著抑制786-O 细胞增殖、迁移和上皮间质转化,且miR-19a-3p 靶向作用CADM2 并下调其表达水平（P<0.05 或P<0.01）。敲减miR-19a-3p 通过靶向上调CADM2 并阻断AKT信号通路进而显著抑制786-O细胞增殖、迁移和上皮间质转化（均P<0.05 或P<0.01）,从而缓解肾癌发生发展。结论：肾癌组织中miR-19a-3p 高表达,敲减miR-19a-3p 可显著抑制肾癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化,其机制可能是通过miR-19a-3p/CADM2/AKT分子轴起作用。     

miR-124通过调节Jagged1/Notch信号通路影响肾细胞癌OS-RC-2细胞的恶性生物学行为

目的：探讨miR-124通过调节Jagged1(JAG1)/Notch信号通路对肾细胞癌(RCC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法：收集2018年6月至2021年10月在武汉市第三医院治疗的38例RCC患者的RCC组织和癌旁组织标本,并体外培养RCC细胞(Caki-2、A498、ACHN、786-O、OS-RC-2)和人正常肾细胞(293T),采用免疫组织化学法、qPCR和WB法检测miR-124和JAG1蛋白在RCC组织和细胞中的表达水平。选择miR-124表达与293T细胞差异最大的OS-RC-2细胞进行转染,按转染物不同分为Control组、NC mimic组、miR-124 mimic组、miR-124 mimic+pcDNA组和miR-124 mimic+pc-JAG1组。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-124与JAG1的关系;q PCR法检测miR-124、JAG1 mRNA表达;免疫组化法分析JAG1蛋白表达;WB法检测JAG1、凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3、BAX和Bcl2)和Notch信号通路相关蛋白(NICD、HES1和HES5)的表...     

siRNA干扰FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响

目的:探讨FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达,并观察小干扰RNA沉默FLOT2基因对肾细胞癌786-O细胞增殖能力的影响。方法:将化学合成的FLOT2的小干扰siRNA用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786-O细胞;分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞转染前后FLOT2以及细胞增殖相关因子CCND1的表达。CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果:转染FLOT2-siRNA的肾细胞癌786-O细胞,RT-PCR、Western blot检测显示FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P<0.05）;与对照组比较786-O细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞增殖相关因子CCND1明显下调（P<0.05）。结论:FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达,采用特异性FLOT2-siRNA 能够显著降低FLOT2和CCND1表达。干扰FLOT2表达能显著抑制786-O细胞的增殖,FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。     

肾透明细胞癌中miR-200c负性调控ZEB2基因表达的机制研究

目的:探讨肾透明细胞癌中miR-200c调控ZEB2基因表达的分子机制。方法:实时定量PCR法检测肾透明细胞癌及癌旁组织中miR-200c及ZEB2基因的表达水平。培养肾透明细胞癌Caki-1细胞,将miR-200c的前体转染Caki-1细胞,Western blot法检测ZEB2蛋白的表达改变,荧光素酶报告基因表达分析实验验证miR-200c与ZEB2基因的3' 非翻译区(3' UTR)的结合及调控作用。结果:实时定量PCR表达检测显示,与癌旁组织相比,miR-200c在肾透明细胞癌组织中的表达显著下调,而ZEB2 mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达则呈现明显上调。Pearson相关性分析结果表明,在肾透明细胞癌及癌旁组织中miR-200c与ZEB2基因的表达均显示负性相关。荧光素酶报告基因表达分析实验明确miR-200c能够与ZEB2基因的3' UTR特异性地结合,并抑制荧光素酶的表达。miR-200c前体能够显著下调Caki-1细胞中ZEB2蛋白的表达。结论:miR-200c与ZEB2基因的表达异常与肾透明细胞癌相关,在肾透明细胞癌细胞中miR-200c能够负性调节其靶基因ZEB2的表达。     

肾癌细胞系SN12C 和786-O 无血清培养的干细胞球特性的比较*

目的:本研究通过比较SN12C 和786-O两株肾癌细胞系中肿瘤干细胞特征的差异性,初步探讨筛选肾癌干细胞更有效的方法。方法:以无血清培养法培养SN12C 和786-O细胞,比较其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异;应用流式细胞术分析SN12C 和786-O球体细胞中干细胞标志物的表达情况;利用裸鼠体内成瘤模型检测SN12C 和786-O球体细胞成瘤能力。结果:SN12C 较786-O更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短,即786-O在无血清培养的第7 天开始形成规则的球体,而SN12C 则在第5 天就已形成规则的球体。SN12C 和786-O球体细胞中干细胞指标表达量亦有显著性差异,在SN12C 球体细胞中CD133、CD44、Nanog和Oct3/ 4 比例明显高于786-O球体细胞,差异具有统计学意义（P < 0.05）。 裸鼠体内的成瘤能力实验发现SN12C 明显强于786-O球体细胞。结论:SN12C 肾癌细胞系通过无血清培养方法富集肿瘤干细胞球明显多于786-O,是获得肿瘤干细胞较好的研究对象。