水飞蓟素对肝纤维化小鼠的保护作用及机制探讨

目的探讨水飞蓟素抗CCl4和酒精所致肝纤维化的作用和机制。方法50只♂昆明小鼠随机分为5组,模型组小鼠皮下注射CCl4并饮用酒精制造肝纤维化模型,治疗组以低、中、高3种不同浓度(50、100、200mg.kg-1)的水飞蓟素灌胃进行干预,正常组小鼠皮下注射等量植物油并用生理盐水灌胃。通过检测血清AST、ALT水平、肝脏病理组织学变化、肝脏组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ)mRNA表达水平观察水飞蓟素的疗效。结果成功建立肝纤维化模型,模型组小鼠血清AST、ALT,肝脏组织TGF-β1、α-SMA及collagen-ⅠmR-NA表达水平增高,水飞蓟素可降低血清AST、ALT水平,降低肝组织TGF-β1、α-SMA及collagen-ⅠmRNA的表达,减轻肝纤维化程度,中剂量(100mg.kg-1)疗效最好。结论水飞蓟素对酒精和CCl4所致的肝脏损伤有明显保护作用,其机制可能与降低TGF-β1mRNA的表达、抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化有关。     

蛇床子素通过抑制小鼠心肌成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路降低胶原表达的研究

目的 研究蛇床子素降低真核载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染的小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)胶原的表达是否与抑制TGF-β1/Smad信号通路相关。方法 用真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染小鼠CFs，然后在TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理或不预处理的情况下，用不同浓度的蛇床子素处理CFs 24 h。ELISA检测上清TGF-β1水平，Western blotting检测细胞内α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7的蛋白表达。结果 真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染CFs后，TGF-β1释放量增加，提示建立了TGF-β1过表达的细胞模型。TGF-β1过表达的CFs经蛇床子素(5~20 μmol·L^-1)处理24 h后，TGF-β1、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达降低，Smad7蛋白表达上升。TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理2 h后，蛇床子素对α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达的抑制作用进一步增强。结论 蛇床子素可以通过直接抑制TGF-β1的产生和Smad通路下调α-SMA和胶原蛋白的表达，这可能是其抗纤维化的机制之一。     

裂果薯总皂苷抗大鼠肝纤维化作用及其机制

目的研究裂果薯总皂苷(SFSP)对四氯化碳(CCl_4)诱导的肝纤维化大鼠的作用及其机制。方法将♂SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、秋水仙碱组(Col)、SFSP低剂量组(SFSP-L)、SFSP高剂量组(SFSP-H)。连续给药4周后,检测各组大鼠ALT、AST和羟脯氨酸的含量;ELISA法检测肝纤维化标志物;HE染色观察肝组织病理学改变;Masson染色观察肝纤维化程度;透射电镜观察肝超微结构变化;qPCR法检测α-SMA、TGF-β1、Smad4、Smad7 mRNA的表达情况。结果肝纤维化模型组AST、ALT及CⅣ、PCⅢ、LN、HA、Hyp反映肝损伤和纤维化进程的指标,均明显升高(P<0.05),而SFSP-H组和Col组明显降低上述指标含量,HE、Masson染色结果与之一致;SFSP明显抑制TGF-β1、Smad4、α-SMA mRNA的表达(P<0.01),升高Smad7的表达(P<0.01)。结论 SFSP通过抑制TGF-β1/Smad信号通路,明显抑制大鼠肝纤维化程度。     

银杏叶提取物对TGF-β1诱导的人Tenon's囊成纤维细胞增殖的影响及其机制的初步探讨

目的:观察银杏叶提取物(GBE)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon's囊成纤维细胞(H TCFs)增殖的影响及可能机制.方法:体外培养HTCFs及鉴定;MTT法检测不同浓度的GBE(25、50、100、200 mg/L)对TGF-β1(2 ng/mL)诱导的HTCFs增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法观察α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的情况.RT-PCR检测细胞结缔组织生长因子mRNA(CTGF mRNA)的表达.结果:TGF-β1可显著促进HTCFs的增殖,促进细胞由G0/G1期进入S期,上调α-SMA、CTGF在蛋白和mRNA水平的表达;GBE能够抑制TGF-β1的上述作用.结论:GBE具有抑制TGF-β1诱导的人Tenon's囊成纤维细胞增殖的作用,其机制可能是阻止细胞进入S期,下调α-SMA及CTGF的表达.     

雷公藤内酯醇减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞活化与抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相关

目的通过体内外实验,观察雷公藤内酯醇(TPL)减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞(MFBs)活化与TGF-β1/ERK/Smad3通路的相关性。方法以TGF-β1刺激成纤维细胞建立体外MFBs活化模型,C57BL/6小鼠胸部照射形成体内MFBs活化、放射性肺纤维化模型。MFBs活化状态通过检测小鼠成纤维细胞中α-SMA(RT-PCR、Western blot方法)和ColⅠ(RT-PCR、ELISA方法)的表达,通路活性采用Western blot法检测p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平。ERK siRNA及Smad3 siRNA观察ERK、Smad3在MFBs活化中的地位。结果 TGF-β1激活p-ERK/p-Smad3(Ser208)及p-Smad3(Ser423),诱导成纤维细胞表达α-SMA,活化为MFBs,合成Col I明显增多;使用ERK siRNA及Smad3 siRNA确定了ERK及Smad3均参与α-SMA、ColⅠ的表达,其中ERK可能通过磷酸化Smad3连接区(Ser208)起相关作用。小鼠胸部照射可致肺组织中p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平上调,α-SMA表达增加,显示多量MFBs活化。TPL对体内和体外实验中ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)的磷酸化活化均有明显抑制作用,可明显下调α-SMA表达及ColⅠ合成,减少MFBs的活化。结论 TPL可通过抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路,减少肺部照射后MFBs活化,从而抑制放射性肺纤维化进展。     

贝那普利对氧化低密度脂蛋白诱导的肾小管上皮细胞间质转化及转化生长因子-β/Smad通路的影响

目的探讨贝那普利对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的肾小管上皮NRK-52E细胞间质转化(EMT)及转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路的影响。方法体外培养NRK-52E细胞,分为对照组、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL)、贝那普利组(50μg/mL ox-LDL+10μmol/L贝那普利)、TGF-β1组(50μg/mL ox-LDL+5 ng/mL TGF-β1)、贝那普利+TGF-β1组(50μg/mL ox-LDL+5 ng/mL TGF-β1+10μmol/L贝那普利)。高倍光学显微镜观察各组NRK-52E细胞表型变化;免疫荧光染色法检测EMT标志性蛋白α-SMA、E-cadherin荧光强度;免疫印迹法检测各组NRK-52E细胞中α-SMA、E-cadherin蛋白及TGF-β/Smad通路蛋白表达水平。结果与对照组比较,ox-LDL组梭形或不规则形细胞增多,α-SMA荧光强度及α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05);E-cadherin荧光表达强度减弱,蛋白量明显降低(P0.05)。与ox-LDL组比较,贝那普利组细胞表型改变明显减轻,α-SMA荧光表达强度明显减弱,α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著降低(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显升高(P0.05);TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度及α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05),Ecadherin荧光表达强度及蛋白量明显降低(P0.05)。与贝那普利组比较,贝那普利+TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度明显增强,α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显降低(P0.05)。与TGF-β1组比较,贝那普利+TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度及α-SMA、TGF-β1、pSmad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著降低(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显升高(P0.05)。结论贝那普利可逆转ox-LDL诱导的肾小管上皮NRK-52E细胞间质转化的发生,机制可能是通过抑制TGF-β/Smad通路活化而发挥作用。     

白藜芦醇通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路抗糖尿病肾病

目的观察白藜芦醇对大鼠糖尿病肾病的干预作用,并探讨其对肾脏转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad2信号通路的影响。方法雄性SD大鼠29只,随机分为对照组(n=5)、模型组(n=12)和白藜芦醇组(n=12)。链脲佐菌素(STZ)65 mg.kg-1造模,白藜芦醇组自造模前1 d至造模后28 d给予白藜芦醇5 mg.kg-1,ig,qd,对照组和模型组给予同体积生理盐水灌胃。检测各组大鼠体重、空腹血糖、血尿素氮(BUN)水平,计算肾脏指数,HE、Pas及Masson染色观察肾脏病理形态变化;real-timePCR法检测肾脏TGF-β1、Smad2、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(FN)mRNA表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠体重下降,肾脏结构出现紊乱和间质纤维化,肾脏指数、空腹血糖和血BUN水平升高(P<0.01),TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA表达量均上调(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,白藜芦醇组大鼠体重升高,肾脏异常病理有所改善,而肾脏指数、空腹血糖和血BUN水平降低,TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达水平也下调,差异均有显著意义(P<0.05或P<0.01)。结论白藜芦醇能改善STZ诱导的DN,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。     

通心络对糖尿病大鼠心肌纤维化的防治作用

目的探讨通心络对糖尿病大鼠心肌纤维化的防治作用及机制。方法用链脲佐菌素制备大鼠糖尿病模型并给予通心络灌胃,12周后测定各组大鼠心脏重量指数,胶原容积积分,免疫组化测定心肌中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7的蛋白表达水平,RT-PCR法检测TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表达水平。结果糖尿病组大鼠心脏重量指数、胶原容积积分明显增高,TGF-β1、Smad3蛋白的表达增加,Smad7蛋白的表达减少;TGF-β1、Smad3mRNA的表达增加,Smad7mRNA的表达减少,通心络组上述指标均得到改善。结论通心络对糖尿病大鼠心肌纤维化有防治作用,其作用机制可能通过改善糖尿病大鼠心肌中TGF-β1、Smad3、Smad7的表达,从而减轻和延缓糖尿病大鼠心肌的纤维化有关。     

吲哚-3-原醇对博莱霉素所致小鼠肺纤维化的干预作用及其机制

目的观察吲哚-3-原醇(indole-3-carbinol,I3C)对博莱霉素致小鼠肺纤维化的干预作用并初步探讨其机制。方法Imprinting Control Region(ICR)小鼠随机分为6组:正常组、模型组、醋酸泼尼松组(6.67 mg.kg-1)、吲哚-3-原醇小、中、大剂量组(25、50、100 mg.kg-1)。小鼠气管内注射博莱霉素制备肺纤维化模型后,第2天给予相应药物,每天1次。连续给药28 d后处死小鼠检测其肺系数、血清和肺组织羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)、血清总抗氧化能力(To-tal antioxidative capacity,T-AOC);取固定部位肺组织切片HE染色,进行病理学观察;RT-PCR法检测肺组织中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β、Smad2 mRNA的表达;Western blot法检测肺组织中α-SMA、TGF-β、Smad2蛋白的表达。结果吲哚-3-原醇能够提高小鼠血清的总抗氧化能力(P<0.05或P<0.01),同时可以降低肺系数和肺组织中的HYP含量(P<0.05或P<0.01);光镜观察表明吲哚-3-原醇能明显减轻肺纤维化小鼠肺泡炎和肺纤维化程度(P<0.05或P<0.01);RT-PCR检测发现吲哚-3-原醇能明显降低肺组织α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β、Smad2基因表达水平(P<0.05或P<0.01);Western blot分析结果说明吲哚-3-原醇能明显降低肺组织α-SMA、TGF-β、Smad2蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论吲哚-3-原醇可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路来减轻博莱霉素致小鼠肺纤维化。     

去甲斑蝥素对TGF—β1诱导的人近端肾小管细胞上皮细胞转分化及信号蛋白Smad2／3表达的影响

目的探讨去甲斑蝥素对体外人源性肾小管细胞株（HK－2）上皮细胞间质转分化（epithelial—mesenchymal transition,EMT）以及信号蛋白Smad2／3的影响。方法体外培养HK2细胞,分为对照组、TGF-β1组和去甲斑蝥素组（NCTD组）。对照组为无血清DMEM培养,TGG-β1组为TGF-β1 5ng·mL^-1诱导,NCTD组为不同浓度NCTD（0．5、1．0、2．5μg·mL^-1）与TGF-β1（5ng·mL^-1）共同作用,各组作用时间48h。使用半定量RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮性钙黏附蛋白（Ecadherin）与Smad2、Smad3mRNA表达;采用Western blot检测α-SMA、E-cadherin、Smad2／3、p-Smad2／3蛋白质表达。结果与对照组相比,TGF-β1组α—SMAmRNA及其蛋白表达明显上调（Pd0．05）,E-cadherin mRNA及其蛋白表达显著下调（P〈0．05）;与TGF-β1组相比,NCTD干预组α—SMAmRNA及其蛋白表达明显下调（P〈0．05）,而E-cadherin mRNA及其蛋白表达显著上调（P〈0．05）,且均呈剂量依赖性。与对照组相比,TGF-β1组Smad2、Smad3rnRNA和Smad2／3、p-Smad2／3蛋白表达上调（P〈0．05）;与TGF-β1组比较,NCTD干预组Smad2、Smad3mRNA和Smad2／3、p-Smad2／3蛋白表达下调（P〈0．05）,具有剂量依赖关系。结论去甲斑蝥素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,该作用可能与其下调信号蛋白Smad2／3的表达有关。     

粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化

目的观察低浓度粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对培养的大鼠肝星状细胞(HSC)活化和转化生长因子β1(TGFβ1)促活化作用的影响,并探讨该作用与TGFβ1受体后信号通路的关系。方法HSC原代培养,给予Tet(0.4、0.8、1.6和3.2μmol·L-1)处理,免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达,或给予TGFβ1(质量浓度5μg·L-1)和(或)Tet(1.6μmol·L-1)干预,分别以RTPCR和Westernblot法检测TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad3、Smad7以及αSMAmRNA和(或)蛋白表达。结果Tet(0.4～3.2μmol·L-1)能抑制培养HSC表达αSMA。Tet(1.6μmol·L-1)抑制TGFβ1诱导的HSCαSMA表达,伴有Smad7表达上调及TGFβ1表达下降,但不影响TGFβⅠ、Ⅱ型受体和Smad3表达。结论低浓度Tet抑制培养HSC的活化和TGFβ1促活化作用,该作用与上调Smad7表达并抑制TGFβ1有关而不影响TGFβ受体表达。     

三七总苷对酒精性肝损伤大鼠肝脏TGV-β1／Smads、CTGFmRNA表达的影响

目的 研究三七总苷对酒精性肝损伤大鼠肝脏TGF-β1/Smads和CTGF表达的影响。方法 大鼠灌服白酒-玉米油-吡唑混合液14周,建立酒精性肝损伤模型。成模大鼠随机分成模型组、三七总苷组（高、低剂量组）、水飞蓟素组,同时另设正常对照组,均治疗4周后,测定肝功能、大鼠肝组织TGF-β1、Smad3、Smad7、CTGFmRNA的表达量。结果 与模型组比较,三七总苷组能明显降低血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）以及总胆红素（TB）水平,减少肝组织TGF-β1、Smad3、Smad7、CTGF mRNA的表达量;不同剂量组之间,差异有统计学意义（P〈0.05）;高剂量三七总苷组与水飞蓟素组之间,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 三七总苷与对酒精性肝损伤大鼠肝脏TGF-β1/Smads、CTGF表达有抑制作用。     

Ubiquitination and regulation of Smad7 in the TGF-β1/Smad signaling of aristolochic acid nephropathy

Abstract

Aristolochic acid I (AAI) affects TGF-β1/Smad signaling, which causes AA nephropathy (AAN), but the mechanisms are not fully understood. We aimed to clarify whether Arkadia and UCH37 participate in TGF-β1/Smad signaling via Smad7, and the regulatory mechanisms of Smad7. One side, mice and cultured mouse renal tubular epithelial cells (RTECs) were treated with various AAI doses and concentrations, respectively; on the other side, RTECs were transfected with small interfering RNA (siRNA) expression vectors against Arkadia and UCH37 and then treated with 10?µg/ml AAI. And then detect the mRNA and protein levels of Smad7, UCH37, Arkadia and any other relative factors by RT-PCR and Western blotting. In kidney tissues and RTECs, the mRNA and protein levels of Smad7 decreased with increasing AAI doses concentrations by real-time PCR and Western blotting, whereas those of Arkadia, UCH37, Smad2, Smad3 and TβRI increased. Cells transfected with the Arkadia siRNA expression vector showed reduced mRNA and protein levels of vimentin, α-SMA, Smad2, Smad3 and TβRI after AAI treatment, while those of CK18 and Smad7 increased compared with those of untransfected RTECs. Conversely, cells transfected with the UCH37 siRNA expression vector showed the opposite effect on analyzed signaling molecules after AAI treatment. Arkadia and UCH37 participate in TGF-β1/Smad signaling-mediated renal fibrosis, and Smad7 blocks TGF-β1 signaling by inhibiting Smad2/Smad3 phosphorylation and enhancing the degradation of TβRI.     

Evodiamine ameliorates liver fibrosis in rats via TGF-β1/Smad signaling pathway

Liver fibrosis is considered to be a result of chronic liver pathological changes, and hepatic stellate cells (HSCs) play an important role during this process. Evodiamine, an indole alkaloid derived from Evodia rutaecarpa, exhibits pharmacological activities. This study focused on the effects of evodiamine on carbon tetrachloride (CCl₄)-induced liver fibrosis in rats and HSCs in vitro via the TGF-β1/Smad signaling pathway. A liver fibrosis rat model was established by the intraperitoneal injection of CCl₄ (3 ml/kg, 30% in olive oil). Evodiamine (15 and 25 mg/kg) was administered orally for 8 weeks. HSCs were treated with different evodiamine concentrations. The results indicated that evodiamine could improve the histopathological abnormalities in liver tissues and decrease the level of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), hydroxyproline, and total bilirubin (TBIL). Concentrations of IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), collagen-I (COL-I), and collagen-III (COL-III) were reduced by evodiamine. Western blotting and real-time PCR showed that protein expression of transforming growth factor-β (TGF-β1), p-Smad 2/3 (phosphorylation of Smad 2/3), and smooth muscle alpha-actin (α-SMA) as well as mRNA expression of TGF-β1 and α-SMA in liver tissues were downregulated by evodiamine. The cell proliferation, production of hydroxyproline, and the protein expression of TGF-β1, p-Smad 2/3, and α-SMA in HSCs were dose-dependently reduced by evodiamine. Collectively, evodiamine had an antifibrosis effect in CCl₄-induced liver fibrosis, and reduced HSCs proliferation and collagen metabolism in vitro. The major mechanism was downregulation of relative expression of TGF-β1, p-Smad 2/3, and α-SMA.     

Smad7和TGF—β1在结直肠癌中的表达及意义

目的检测Smad7和TGF—β1在结直肠癌中的表达,探讨其在不同临床病理特征中的表达意义,以期为研究结直肠癌的发生发展提供理论帮助。方法本实验以140例结直肠癌标本作为研究对象,70例正常结肠黏膜组织作为对照,采用免疫组织化学技术,分别检测Smad7和TGF—β1的表达及其在不同临床病理特征之间的关系。结果结直肠癌中Smad7和TGF—β1的表达明显低于对照组,Smad7和TGF-β1的表达与结直肠癌浸润深度、Dukes分期及淋巴结转移密切相关,二者在结直肠癌中的表达呈正相关。结论Smad7和TGF-β1在结直肠癌发生发展中具有重要协同作用,联合检测Smad7和TGF-β1的表达可能与判断预后有关。     

Beta-谷甾醇通过抑制TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3信号通路抗小鼠肝纤维化损伤

目的探讨Beta-谷甾醇对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL 4)诱导的小鼠肝纤维的作用与机制。方法50只C57BL/6♂小鼠随机分成5组:正常组、CCL 4组、Beta-谷甾醇低中高剂量组(BS-L/M/H),每组10只。腹腔注射CCL 4制肝纤维化模型,共30 d,于前15 d灌胃不同剂量Beta-谷甾醇。处死后,观察大体形态,测量肝指数,HE和Masson染色观察肝组织和胶原纤维,Elisa测血清(ALT)、(AST)变化,免疫组化和Western blot检测α-SMA、CollagenⅠ的表达,Elisa和Western blot检测信号通路TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3的变化。结果与正常组比,BS各组显著性地抑制了CCL 4引起的肝指数、ALT、AST、α-SMA、collagenⅠ的增高,该作用呈量效依赖性(P<0.05或P<0.01),BS各组肝形态、炎症细胞浸润与胶原纤维变化也呈剂量依赖性优于模型组,同时,BS-M降低了信号通路中TβR1、Smad2/3、TNF-α和p-NF-κB因子的表达(P<0.05)。结论Beta-谷甾醇呈剂量依赖抑制CCL 4诱导的小鼠肝纤维化,且其作用机制与抑制TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3信号通路相关。