重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定

目的利用大肠杆菌表达载体,表达血红蛋白(Hb)基因,并进行纯化及鉴定。方法将原核表达载体pHE 2-Hb转化入E.Coli JM109,经IPTG诱导表达;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,用Western blot鉴定纯化出的目的蛋白。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量约为67 kD,与理论值相一致;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,Western blot检测表明得到纯度较高的目的蛋白。结论利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究Hb的生物传氧机制研究和以Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。     

用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达

目的 用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达。方法 将原核翻译增强子序列插入到质粒pRIT-2T启动子的下游，再与成骨生长肽融合蛋白基因重组。热诱导表达融合蛋白，经亲和层析、Factor Xa酶切、凝胶过滤层析得到纯化的成骨生长肽。结果 提高了成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达水平，使成骨生长肽融合蛋白的表达量超过了大肠杆菌蛋白总量的50％。结论 原核翻译增强子可提高外源基因在大肠杆菌中的表达。插入了原核翻译增强子的pRIT-2T质粒可作为高效表达融合蛋白的通用质粒载体。     

土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE的克隆与表达

目的 克隆表达土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE,为研究lovE蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体pET21b(+)构建lovE原核表达质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白.结果 构建了pET-lovE原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得6×His-lovE融合蛋白,蛋白纯度...     

B细胞活化因子的纯化和复性参数的优化研究

目的获得高纯度和高活性的B细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF).方法重组原核表达载体pQE-80L-BAFF112-285在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导表达rhBAFF112-285,超声碎菌,提取包涵体,经Ni2 -NTA亲和层析和Sepharcryl S-200凝胶过滤层析纯化后,选择不同氧化还原条件进行复性,进而检测其生物学活性.结果得到了有较高纯度和较好生物学活性的rhBAFF112-285蛋白.结论优化了BAFF蛋白的纯化和复性的参数,所获结果为进一步研究创造了条件.     

Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：获得人Flt3配体(FL) cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。方法：提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层 析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性。结果：经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致。构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25 000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25 000处可见特异性着色带。结论：构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白。     

东亚钳蝎钙通道样毒素的克隆与其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆东亚钳蝎钙通道样毒素(BmCa)基因,并构建原核表达质粒,在大肠杆菌中重组表达该毒素蛋白.方法:以东亚钳蝎尾毒腺的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增并克隆BmCa的cDNA基因,并将该基因重组到PET-GST表达载体中,转化入大肠杆菌BL21并诱导表达,采用Ni-SuperChelating Resin柱亲和层析纯化,用小白鼠毒性实验检测融合蛋白的活性.结果:成功克隆BmCa基因并构建原核表达质粒,IPTG诱导后表达分子质量约为33KD的融合蛋白,含量为大肠杆菌总蛋白的25%,经亲和层析得较高纯度的融合蛋白,小白鼠毒性实验表明融合蛋白具有活性.结论:在大肠杆菌中成功表达了有活性的东亚钳蝎钙通道样毒素蛋白,为其功能研究奠定基础.     

亲环素A的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的构建人亲环素A(CypA)基因的原核表达载体,诱导表达、纯化蛋白,制备抗体,为进一步研究其生物学作用奠定基础。方法以人肺癌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增CypA基因片段,克隆到pMD18-T载体中。扩增产物与原核表达载体pET30a(+)连接,构建表达质粒pET30a-CypA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍树脂亲和层析柱High-Affinity Ni-IDA Resin纯化表达产物,SDS-PAGE检测纯化蛋白。用获得的蛋白免疫大白兔,制备抗CypA蛋白多抗,采用蛋白印迹法检测抗体特异性。结果成功构建了CypA的原核表达载体,经大肠杆菌诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到纯度达80.2%的融合蛋白,免疫大白兔后得到多抗血清。蛋白印迹结果显示此多克隆抗体能与CypA蛋白特异性结合。结论成功获得CypA纯化蛋白及CypA多克隆抗体,为进一步研究CypA在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。     

趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建趋化因子受体5(CCR5)胞外段重组蛋白(命名为:rCCR5)原核表达载体,并进行诱导表达.对表达产物进行纯化和鉴定.方法:截取CCR5胞外结构4个片段N-Term,ECL1, ECL2和ECL3的氨基酸序列,应用柔性linker分别串联,模拟CCR5胞外结构,依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Western blot鉴定.结果:目的蛋白以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、变性溶解,SephacrylS-300凝胶过滤层析及SephacrylS-100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质,目的蛋白能与CCR5 mAb特异性结合.结论:获得了大量纯化的rCCR5重组蛋白,可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV-1感染的候选抗原蛋白.     

高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI+的表达纯化

目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI .