WO-1生物衍生骨支架与成骨细胞相容性的实验研究

目的 研究WO-1生物衍生骨复合材料与兔成骨细胞的相容性及体外附着规律，为进一步的体内试验提供基础研究。方法 应用同种异体骨、Ⅰ型胶原及WO-1制备WO-1生物衍生骨复合材料；取幼兔的颅顶骨成骨细胞，经培养液体外培养、扩增后，与WO-1生物衍生骨材料联合培养。通过扫描电镜和倒置相差显微镜观察WO-1生物衍生骨复合材料的形貌特征、细胞与材料的粘附和增殖情况。结果 WO-1生物衍生骨复合材料具有天然骨的三维结构；扫描电镜和倒置相差显微镜均显示复合培养的成骨细胞在材料表面和孔隙内生长良好。结论 WO-1生物衍生骨复合材料具有良好的细胞相容性。     

生物衍生骨支架材料的组织相容性研究

目的 了解不同处理方法制得的3种生物衍生骨支架材料的组织相容性。方法 将物理化学方法处理制得的复合型完全脱蛋白骨（composite fully deproteinized bone,CFDB)、部分脱蛋白骨（partially deproteinized bone,PDPB)、部分脱钙骨（partially decalcified bone,PDCB)3种材料各10块分别植入兔肌肉内及骨膜下，进行一般观察、血清抗体检测、局部细胞免疫评估、常规HE染色，观测3种材料对机体的毒性作用、免疫效应及骨膜成骨的影响。结果 3种材料均无毒性作用，且能引导周围组织长入材料内；3种材料对骨膜成骨无不良影响，且能促进骨膜形成的软骨或类骨组织钙化形成新骨，并有一定的骨结合能力；3种材料引起机体免疫反应强弱为：PDCB＞PDPB＞CFDB。结论 CFDB、PDPB、PDCB3种天然生物衍生骨材料皆有良好的生物相容性。     

生物衍生骨支架材料的体外细胞相容性实验研究

目的 评价不同处理方法制备的生物衍生骨支架材料的细胞相容性。方法 将支架材料,即复合型完全脱蛋白骨（CFDB）、部分脱蛋白骨（PDPB）和部分脱钙骨（PDCB）与人胚骨膜来源的成骨细胞体外复合培养,采用倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电镜、流式细胞仪及碱性磷酸酶（ALP）活性检测,观察支架材料的细胞相容性。结果 三种材料上皆有细胞附着生长,三种材料对细胞增殖影响大小为PDCB＞PDPB＞CFDB;三种材料对成骨细胞的细胞周期影响较小,未见异倍体细胞;三种材料对成骨细胞ALP活性的影响大小依次为PDCB＞PDPB＞CFDB。结论 CFDB、PDPB及PDCB无细胞毒性、无致瘤性,皆有良好的细胞相容性,以CFDB为最好。三种材料皆可用于骨组织工程的支架材料。     

WO-1生物衍生组织工程骨支架材料的制备及性能研究

目的制备WO-1胶原生物衍生骨复合支架材料,检测其理化性质及力学强度,为骨组织工程研究和应用提供可选择的支架材料。方法将同种异体骨、I型胶原、WO-1进行系列理化处理,制成单纯生物衍生骨材料、胶原生物衍生骨复合材料及WO-1胶原生物衍生骨复合材料。制备后的材料行大体及扫描电镜观察其形貌特征,X线衍射分析材料成分,并对材料的力学性能进行分析测定。结果单纯生物衍生骨材料具有天然骨的网状孔隙系统;胶原生物衍生骨复合材料具有天然骨的网状孔隙系统,微孔表面覆盖胶原膜;WO-1胶原生物衍生组织工程骨复合支架材料具有骨组织的天然网状孔隙系统,微孔表面可见胶原膜覆盖。3种材料的孔径依次为90～700μm、75～600μm、80～600μm;孔隙率依次为87.96%、80.47%、84.29%,差异无统计学意义(P>0.05);其主要成分为羟基磷灰石,弯曲强度和压缩强度无统计学意义(P>0.05)。结论WO-1胶原生物衍生骨复合材料与其它两种材料相同,可作为一种有效的天然组织工程骨支架材料。     

不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响

目的了解不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响.方法冻干生物衍生骨用两种不同保存液同等条件4℃冷藏保存3个月,以保存相同时间冻干生物衍生骨为对照.实验分为A组:成骨细胞复合 1号保存液处理材料培养;B组:成骨细胞复合 2号保存液处理材料培养;C组:成骨细胞复合冻干骨培养;D组:单纯成骨细胞培养.以2×106个/ml密度的成骨细胞悬液复合材料培养1、3、5和7天.用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附和生长情况、检测细胞活力、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及流式细胞仪分析细胞周期.结果成骨细胞与三种不同方法保存的材料均可黏附,并在材料孔隙内生长、分化和增殖.复合培养1和3天,各组间无显著差异;复合培养5和7天,黏附于材料的细胞活力大小依次为 A组>C组>B组 (P＜0.01,P＜0.05).复合培养7天,黏附于材料的细胞ALP活性大小依次为 A组>C组>B组(P＜0.01) .各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞.结论选择适宜的保存液对生物衍生骨支架材料的细胞相容性有一定优化作用.     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

转染特异性报导基因成骨细胞生物学性状及其与骨支架材料生物相容性的研究

目的研究转染特异性报导基因成骨细胞的生物学性状，并观察该细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。方法常规复苏培养转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞，通过倒置相差显微镜、HE染色、I型胶原免疫组化法染色、碱性磷酸酶（ALP）偶氮偶联法染色、矿化结节茜素红法染色及四环素法染色观察该转基因成骨细胞的生物学性状；并将其与纳米磷酸钙复合骨支架进行体外复合培养，通过扫描电镜观察该转基因成骨细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。结果转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞经培养后能贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，能分泌胶原基质和ALP，经I型胶原免疫组化法染色及ALP偶氮偶联法染色呈强阳性；并能够形成矿化结节，茜素红法染色及四环素法染色呈阳性；该转基因成骨细胞在骨支架材料上具有良好的生长特性和黏附性，并能正常分化、增殖和成熟，分泌大量胶原基质和钙结节。结论转染12×SBE—OC—Luc报导基因后成骨细胞生物学性状未发生改变，其与骨支架材料亦具有良好的生物相容性。     

Pluronic F-127表面修饰生物衍生骨的体外实验研究

目的：探讨成骨细胞复合PluronicF-127表面修饰生物衍生骨的三维培养，对成骨细胞活力及功能表达的影响。方法：将新鲜猪肋骨加工制成生物生骨，应用PluronicF-127对生物衍生骨进行表面修饰，然后体外复合第3代成骨细胞三维培养，实验为A、B和C组，A组为单纯生物衍生骨复合成骨细胞组，B组为PluronicF-127表面修饰生物衍生骨复合成骨细胞组，C组为单纯成骨细胞组，应用倒置相差显微镜和扫描电镜对各组成骨细胞生长及黏附进行观察，并对其细胞活力碱性磷酸酶（ALP）活性进行检测，结果：B组成骨细胞在支架材料上黏附，伸展及生长良好，成骨细胞活力和ALP活性表达与A组成骨细胞比较均无统计学意义（P＞0．05）；A、B组与C组比较，成骨细胞活性和ALP活性均明显降低，有统计学意义（P＜0．01）。结论：生物衍生骨经PluronicF-127表面修饰后具有良好的细胞相容性，可作为负载生物活性分子的载体修饰生物衍生骨。     

生物衍生骨材料

目的追溯不同种类生物衍生骨修复骨缺损的研究进展。方法广泛查阅近期相关文献，综述不同种类生物衍生骨制备方法．以及修复骨缺损的治疗效果。结果采用不同物理化学方法处理的异体骨或异种骨不仅是天然的骨替代材料，还可作为支架材料与种子细胞复合构建组织工程骨，修复骨缺损。结论目前组织工程生物衍生骨是骨缺损治疗的新突破点。     

生物衍生组织工程骨植骨的初步临床应用

目的　总结生物衍生组织工程骨用于骨科临床的初步结果。方法　 2 0 0 0年 1月～ 2 0 0 2年 1月 ,用同种异体骨膜来源的成骨细胞 1× 10 6 / ml与生物衍生骨支架材料构建的组织工程骨 ,经体外培养 3～ 7天后 ,植入修复 5 2例各种类型的骨缺损 ,其中骨囊性病变 7例 ,陈旧性骨折不愈合或畸形愈合 2 2例 ,新鲜粉碎性骨折伴骨缺损 15例 ,脊柱骨折后路植骨融合术 4例 ,牙槽骨植骨 3例 ,足跗中关节植骨融合 1例。植入组织工程骨总量为 349g,平均每例植入6 .7g。结果　术后全部病例获得随访 ,随访时间 10～ 2 8个月 ,平均随访 18.5个月。除 1例术后伤口乙级愈合外 ,5 1例均为甲级愈合。除 2例植骨延迟愈合外 ,其余 5 0例均在 3.0～ 4 .5个月内愈合。有 6例进行了 CD3、CD4、CD8及 ICAM- 1和 VCAM- 1检测 ,均未发现明显异常。结论　生物衍生组织工程骨具有良好的成骨能力 ,尚未发现明显排斥反应及其它并发症     

骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复山羊胫骨缺损的研究

目的　探讨骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells,MSCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨 -骨膜缺损的可行性。　方法　将 12月龄山羊 35只双侧胫骨制备成中段 2 0 mm的骨 -骨膜缺损 ,其中 33只 ,将MSCs与生物衍生骨于体外复合培养后 ,将其植入右侧缺损处 ,常规钢板螺钉内固定作为实验组 ,以单纯生物衍生骨植入左侧作为对照组 ,另 2只为空白组不植入任何材料 ,在 2、4、6、8、12、16及 2 4周各时间点分别行大体标本、组织学观察 ,以及生物力学测试 ,比较 3组骨缺损修复的能力。　结果　 4周时实验组支架材料部分吸收 ,植入物表面有纤维骨痂形成 ,对照组支架材料少量吸收 ,植入物表面有少量骨样组织形成 ;8周时 ,大体标本、组织学观察 ,实验组中的支架材料已完全降解 ,骨缺损部分修复 ,对照组中植入物两端少量新骨形成 ,材料中为纤维骨样组织 ,但 8周时 ,实验组与对照组的生物力学强度差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;12周时 ,实验组骨缺损完全修复 ,对照组植入物两端有新骨包绕 ,与骨端连接紧密。 12～ 2 4周实验组弯曲应力大于对照组有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;2 4周时空白组骨缺损未修复。　结论　所构建的组织工程骨修复能力较强 ,成骨迅速 ,且量大 ,同期新生骨组织的生物力学强度优于单纯     

不同方法制备生物衍生骨体内植入的组织学观察

目的探讨不同方法制备的生物衍生骨植人大耳白兔体内后的组织学变化，为组织工程研究提供异种动物源支架材料。方法取新鲜市售猪股骨两端，除去软组织及骨膜后切割为0．5cm×0．5cm×0．5cm大小骨块。根据不同处理方法分为5组：A组仅用生理盐水冲洗，B组经脱脂处理，C组经脱脂脱钙处理，D组经脱脂脱钙脱细胞处理，E组经脱脂脱细胞处理。取各组骨块行微量元素检测；经25kGy辐照灭菌后植入26只新西兰大耳白兔股部肌袋内，左侧植入A、B组骨块，右侧植入C、D及E组骨块，各肌袋植入1块。术后2、6及12周取材，作HE及Masson染色，行炎性细胞、破骨细胞计数，观察胶原纤维生成及成骨情况。结果各组骨块微量元素残留量符合标准。所有动物术后生存良好。各组实验兔植入部位均未见组织坏死、积液及化脓感染。炎性细胞计数以A组为最多，与其他各组比较差异有统计学意义（P〈O．05）；破骨细胞计数各组间差异无统计学意义（P〉0．05）。HE及Masson染色观察，胶原纤维及新骨形成C、D组为最好，E组次之，A、B组最差。结论脱脂脱钙脱细胞处理的猪股骨有良好的降解性、成骨性及较低的炎性反应，有可能成为组织工程骨的支架材料。     

不同方法保存生物衍生骨修复节段性桡骨缺损的实验研究

目的　探讨不同方法保存的生物衍生骨修复节段性桡骨缺损的效果。　方法　冻干生物衍生骨用两种不同保存液保存 3个月 ,以保存相同时间的冻干生物衍生骨为对照。选择 6 0只新西兰大白兔 ,制作 15 mm长的双侧桡骨节段性骨缺损模型 ,实验根据植入不同方法保存的材料分为 A、 B和 C组。A组植入 1号保存液处理材料 ,B组植入2号保存液处理材料 ,A、B组再根据材料是否复合成骨细胞培养分为 A1 和 A2 、B1 和 B2 组 ,A1 和 B1 组于动物左侧桡骨缺损区植入组织工程生物衍生骨 ,A2 和 B2 组于右侧植入单纯材料。C组分为 C1 和 C2 组 ,于动物左侧桡骨缺损区植入冻干材料 ,右侧为空白对照。术后 4、8和 16周取材 ,摄 X线片、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。　结果　术后 4、8和 16周各组骨缺损区均有新骨生成 ,成骨量随时间的推移而增加。经 X线片、组织学和生物力学评估 ,各组的成骨能力依次为 :A1 >A2 >C1 >B1 >B2 >C2 有统计学意义 (P<0 .0 0 1,P<0 .0 5 ) ,其中 A1 组成骨能力最强 ,术后 16周骨缺损完全修复 ,骨髓腔再通 ,生物力学性能接近正常骨。　结论　选择适宜的保存液对生物衍生骨支架材料的骨修复能力有一定的促进作用。     

骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复山羊胫骨缺损的影像学研究

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨-骨膜缺损,以及修复负重骨缺损的可行性. 方法将18只12月龄健康杂种青山羊(雌雄不限),制备成双侧胫骨中段20 mm骨-骨膜缺损模型,常规钢板螺钉固定;MSCs与生物衍生骨于体外复合培养;对同一只山羊将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组,以单纯材料植入左侧胫骨缺损处作为对照组,空白组不植入任何材料;在8、12、16和24周各时间点分别行标本的大体观察、X线片观察和骨密度测试,比较其修复骨缺损的能力. 结果大体观察、X线片和骨密度测试显示:实验组8周骨缺损部分修复,12、16周骨缺损完全修复,8、12和16周其骨密度较对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05);24周实验组与对照组骨密度差异无统计学意义;空白组骨缺损未修复. 结论组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,且较单纯材料成骨量大、迅速,能够对负重骨缺损进行有效的修复.     

成骨细胞Cbfa1和Osterix基因在体外构建组织工程骨膜中的表达

目的体外构建组织工程骨膜,研究生物衍生羊膜（human acellular amniotic membrane, HAAM）对成骨细胞分化的影响. 方法采用人胚骨膜来源的成骨细胞与HAAM体外复合培养构建组织工程骨膜（n=60）.于培养后2、4、6、8和10 d,分别提取总RNA,经过逆转录成cDNA,行实时定量PCR,分别扩增成骨细胞特异转录因子（Cbfa1）和成骨细胞特异基因（Osterix）,读取扩增循环数（cycle threshold,Ct）.以单纯培养的成骨细胞作为对照组（n=20）. 结果实验组Cbfa1表达以培养后2 d和10 d最高,且培养后2 d与4、6、8 d比较,以及培养后10 d与4、8 d比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;实验组Osterix表达随培养时间延长逐渐升高,培养后8 d达最高,与其余各时间点比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.对照组Cbfa1和Osterix表达均随培养时间延长逐渐降低.组间各时间点两基因表达差异均无统计学意义（P〉0.05）. 结论成骨细胞与HAAM结合后,Cbfa1和Osterix可持续正常表达.HAAM作为支架材料,可诱导并促进成骨细胞分化.成骨细胞与HAAM构建的组织工程骨膜在分子水平已具有产生骨组织的基础.     

Bcl—2和Fas基因在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的研究凋亡基因Fas/Apo-1和抑凋亡相关基因Bcl-2在瘢痕形成机制中的作用.方法采用免疫组织化学方法对10例正常皮肤、10例增生性瘢痕及10例瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas/Apo-1和Bcl-2蛋白的表达进行检测.Fas蛋白稀释为1∶50;Bcl-2蛋白稀释为1∶40,阴性对照以PBS代替一抗.随机选择五个高倍视野,计算其细胞平均阳性率.结果Bcl-2蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为6.78%、38.6%和83.2%.瘢痕疙瘩、增生性瘢痕的表达阳性率高于正常皮肤,有非常显著性差异(P＜0.01),而瘢痕疙瘩的表达阳性率明显高于增生性瘢痕(P＜0.01).Fas/Apo-1蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为78.4%、80.4%和84.4%,三组间无显著性差异(P＞0.05).结论病理性瘢痕的形成与Bcl-2基因的过度表达有关,而对Fas基因介导的凋亡不敏感或凋亡受阻,亦是导致瘢痕过度增生原因之一.     

骨膜成骨细胞培养与生物活性陶瓷复合的实验研究

将成骨细胞与生物活性陶瓷复合培养，赋于材料以“生命”活性，可能会产生一种新型人工材料。为研究成骨细胞与生物活性陶瓷间的关系，选用新西兰大白兔，取胫骨外骨膜组织，经胰蛋白酶及胶原酶分步消化，分离出成骨细胞，用ＲＰＭＩ－１６４０培养液传代培养１３代。通过对培养细胞碱性磷酸酶活性、体外矿化能力测定以及细胞超微结构观察，证实其为典型的成骨细胞。将培养细胞分别在三种生物活性陶瓷，包括生物活性玻璃陶瓷（ＢＧＣ）、羟基磷灰石（ＨＡ）和双相羟基磷灰石（ＨＡ／ＴＣＰ）中培养４８小时后，利用扫描电镜，３Ｈ－ＴｄＲ，ＸＲＤ，ＲＳ和ＥＤＸＡ等进行综合评价。结果表明：ＨＡ／ＴＣＰ上培养成骨细胞较另两种生物材料上显示出更好的类成骨细胞形态和更高的细胞分化率。对成骨细胞与生物活性陶瓷反应的机制进行了讨论，并分析了影响细胞生长的材料因素，其结果为深入研究有生命的材料提供了依据。     

猕猴组织工程骨异体植入后白细胞介素2及其受体的表达

目的　检测猕猴组织工程骨异体植入桥接节段骨缺损后体内白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL - 2 )及白细胞介素 2受体 (interleukin 2 receptor,IL - 2 R)的表达 ,从免疫学方面探讨同种异体细胞作为种子细胞构建组织工程骨的可行性。　方法　用猕猴骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells,MSCs)体外诱导分化为成骨细胞 ,与人源生物衍生骨材料复合培养 ,构建组织工程骨 ,植入 15只免疫功能健全的异体猕猴体内桥接桡骨节段骨缺损作为实验组 ;用单纯生物衍生骨材料桥接对侧同样大小骨缺损作为对照组 ;分别于术后 1、2、3、6和 12周抽取静脉血 ,并行双侧局部组织取材 ,组织块作低温匀浆 ,用双抗体夹心 IL ISA法检测 IL - 2及 IL - 2 R的表达。　结果　实验组和对照组术后各时间点IL - 2及 IL - 2 R水平无统计学差异 (P>0 .0 5 ) ,IL - 2及 IL - 2 R水平在术后第 2周开始增高 ,第 2～ 6周维持高水平 ,6周后随时间的延长而下降。　结论　猕猴 MSCs和生物衍生骨材料复合构建组织工程骨 ,植入异体猕猴体内引发微弱的免疫反应 ,同种异体 MSCs可选择作为构建骨组织工程的种子细胞。