肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。     

肠出血性大肠杆菌O157引起的感染性腹泻

1996年7月初在日本大阪的Sakai市出现了历史上最大的一次肠出血性大肠杆菌(Enterohemorragic Escherichia coli EHEC)O157∶H7爆发性食物中毒,受感染人数达到6千余人,其中大多为6至12岁儿童.患者出现急性腹痛和血性腹泻,92例合并出现了溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrone HUS).这次流行随后波及到了日本的40多个府县,患者总数达到近万人,并且造成7人死亡,后经微生物学检验证实的EHECO157∶H7是导致这次疾病流行的病原菌.     

出血性大肠杆菌O157菌壳的制备研究

目的利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备出血性大肠杆菌O157∶H7菌壳,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法利用PCR技术扩增得到噬菌体PhiX174裂解基因E并克隆到质粒pBV220中,将重组质粒导入出血性大肠杆菌O157∶H7。重组菌株O157∶H7(pBV220::E)培养温度从28℃突升至42℃,每20min检测菌液OD600值,绘制重组菌株生长曲线。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌壳结构。结果获得了PhiX174裂解基因E全长基因及重组质粒,构建了大肠杆菌的重组菌株。重组菌菌液OD600值在温度突升至42℃后40min后开始显著下降,80min后OD600值趋于平稳。细菌的裂解效率为98.4%。电子显微镜观察显示,经诱导后,O157∶H7细菌内容物可以通过细菌表面的孔道流出,从而形成菌壳。结论本研究成功制备了大肠杆菌O157∶H7菌壳,为将来进一步研究O157菌壳的特性奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。     

陕西省O157出血性大肠杆菌分布研究

目的了解陕西省家禽家畜O157大肠杆菌带菌和致病力情况以及市售食品的污染状况,分析对人群可能造成的威胁。方法根据我省不同地域选择监测点,采集监测点内养殖场或个体养殖户养殖的动物粪便1657份;集贸市场和超市销售的7类食品样品877份进行O157大肠杆菌监测,应用PCR技术对分离菌株进行毒力基因检测和流行病学分析。结果从动物粪便中分离出64株O157大肠杆菌,总带菌率3.86%,其中奶牛带菌率最高,达10.89%。从食品样品中分离出6株,总污染率0.68%。70株分离菌通过PCR检测发现,大多数O157大肠杆菌不携带H7鞭毛素fliCH7基因以及stx1、stx2、eaeA、hlyA4种毒力基因,含有fliCH7基因的9株菌则全部携带有stx2、eaeA、hlyA毒力基因,表现为fliCH7基因与已知毒力基因的相关性及分离菌株毒力基因图谱的一致性。结论陕西省猪、牛、鸡动物存在有O157大肠杆菌,并且食品已受到污染,所显示的毒力基因图谱单一,提示陕西省存在有O157大肠杆菌感染的威胁,有造成O157大肠杆菌流行或局部暴发流行的可能。     

肠出血性大肠杆菌O157 EspA的研究进展

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157：H7曾多次在世界各地，特别是发达国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎（hemorrhagic colitis，HC），并经常伴发溶血性尿毒综合征（Hemolytic ruemic syndrome，HUS）、血栓形成的血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）并发症，严重威胁着人类的生命健康。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。目前，对O157：H7感染尚缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗，但研究证明抗菌药物可促使O157：H7大肠杆菌释放Vero毒素，从而使患者并发溶血性尿毒综合征（HUS）的危险性增加。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定

目的提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定,以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值.方法应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原,并经超速离心纯化.提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性.LPS抗原致敏醛化鸡血球,IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清.对凝集阳性的抗血清,经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验,确定抗血清与LPS的反应位置.结果纯化后的O157 LPS抗原含多糖,具鲎试剂凝集活性,未检出核酸,蛋白含量＜0.5%.O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应,而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应,交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清.EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分,而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分.结论热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强,可望应用于抗O157抗体的检测.O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性.     

肠出血性大肠杆菌O157：H7脂多糖抗原的制备及鉴定

目的提取纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7脂多糖（LPS）抗原并对其鉴定,以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值。方法应用热酚水法提取EHECO157：H7S型933株LPS抗原,并经超速离心纯化。提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和尝试剂凝集活性。LPS抗原致敏醛化鸡血球,IHA法检测EHEC157：H7及其它肠道病原菌的抗血清。对凝集阳性的抗血清,经菌体抗原吸收、O157LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验,确定抗血清与LPS的反应位置。结果纯化后的O157LPS抗原告多精,具鲎试剂凝集活性,未检出核酸,蛋白含量＜0．5％。O157LPSIHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应,而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应,交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIECO144：K？及ESIECⅣ抗血清。EHEC157和沙门氏菌O30抗血清与O157LPS反应位置为多糖部分,而EIECO144：K？及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分。结论热酚水法提取的EHECO157LPS抗原纯度高、特异性强,可望应用于抗O157抗体的检测。O157LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性。     

出血性大肠杆菌O157:H7基因多样性与噬菌体的关系

大肠杆菌具有基因型和表型的多样性。尽管大肠杆菌的自然分离株的rRNA操纵子的主序列具有高度保守，但它们的染色体大小差别很大，在4．5～5．5Mb之间^[1]。大多数大肠杆菌是高等脊椎动物的共生菌，但有些是病原菌。致病性大肠杆菌能引起多种疾病，包括局部感染(如腹泻)到全身感染。仅引起腹泻的大肠杆菌至少可分为5种亚型，每种亚     

广西肠出血性大肠埃希菌O157监测研究

目的了解广西人和动物中EHECO157的流行强度与规律,为卫生决策提供依据。方法采集腹泻病人和家禽家畜粪便、苍蝇及生熟肉类食品标本,经mEC肉汤增菌、O157快诊金卡筛选和免疫磁珠富集后,接种CHROMagarO157显色培养基,最后进行生化和血清学鉴定。结果2007-2008年,广西共采集各类标本3964份,从牛粪、猪粪、鸡粪和苍蝇标本中检出O157菌株22株,检出率分别为4.35%、1.27%、0.70%和1.84%,其它标本均未检出。22株O157菌株中有18株O157∶H7、4株O157:H-,分布于4-11月。结论广西家禽家畜和苍蝇均有较高的EHECO157带菌率,存在人感染甚至发生人间暴发流行的危险,应继续加强监测并采取适当措施以降低家禽家畜带菌率。     

大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达

目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,连接到表达载体pET-28a以构建重组质粒。将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,通过IPTG诱导进行表达,对表达蛋白进行SDSPAGE电泳分析和Western检测。结果用PCR方法扩增出了预期大小的VT2B亚基基因,克隆得到重组质粒pET28aVT2B,转化后宿主菌成功表达分子量为8kD的目的蛋白,用特异抗体经Western检测该条带为阳性反应。结论目的基因成功克隆到宿主菌内,目的蛋白得到高效表达,最佳诱导时间为4h,目的蛋白表达量可达总蛋白量45.72%。     

广东地区大肠杆菌O157∶H7的分离与鉴定

目的了解广东地区家畜、肉菜市场及屠宰场中动物、动物源性食品原材料中大肠杆菌O157H7的分布及这些细菌对常用抗菌素的敏感性。了解这些细菌对小白鼠的致病力。方法样品采集送实验室后,接种mEC+n肉汤培养基中于41℃增菌24h,取增菌液接种CTSMAC平板,37℃培养24h,挑取可疑菌落,经血清学检验、微量生化实验初步确认。再用5重PCR对它们进行基因检测确认。然后在小白鼠中进行毒性试验;用药敏试纸测试它们对常用抗菌素的敏感性。结果共检查猪、牛粪便、猪肉样品及肝肺拭子样品共774份,检出4株O157H7,检出率052%;对分离菌株作药物试验,发现菌株对四株素,链霉素、青霉素、磺胺类等存在不同程度的耐药。结论我们首次对广东省作O157H7较全面的调查,分离出4株O157H7。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

EHEC O157：H7基因缺失突变株口服免疫小鼠的实验研究

目的 研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因缺失突变疫苗候选株EHEC86-24(△stx／ler)的安全性和免疫保护效果．为进一步的临床实验提供依据。方法 对出生7d昆明鼠经口服途径进行免疫，分别在一次免疫和加强免疫14d后以O157：H7强毒株EDL933(Nal^R)攻毒。观察小鼠的发病情况、疫苗候选株的保护率及攻毒后的带菌消长情况。同时又作了被动免疫实验，成年母鼠间隔14d口服免疫两次，所生乳鼠7d攻毒。结果 疫苗株以10倍于强毒株最小致死剂量口服接种无致病作用。疫苗株一次免疫保护率可达60％。因小鼠的易感性随日龄和体重的增加而降低，加强免疫后，对照组未能全部致死(死亡40％)，而免疫组全部存活；攻毒后免疫组比对照组排菌时间显著缩短(24h／216h)。两次口服免疫后血清IgG抗体效价达1：1600。被动免疫保护率100％。结论 该突变株通过口服接种能够引起特异性免疫应答反应，具有良好的免疫原性和免疫保护作用。     

EHEC O157∶H7基因缺失突变株口服免疫小鼠的实验研究

目的　研究肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7基因缺失突变疫苗候选株EHEC 86 - 2 4 (Δstx/ler)的安全性和免疫保护效果 ,为进一步的临床实验提供依据。方法　对出生 7d昆明鼠经口服途径进行免疫 ,分别在一次免疫和加强免疫 14d后以O15 7∶H7强毒株EDL933(NalR)攻毒 ,观察小鼠的发病情况、疫苗候选株的保护率及攻毒后的带菌消长情况。同时又作了被动免疫实验 ,成年母鼠间隔 14d口服免疫两次 ,所生乳鼠 7d攻毒。结果　疫苗株以 10倍于强毒株最小致死剂量口服接种无致病作用。疫苗株一次免疫保护率可达 6 0 %。因小鼠的易感性随日龄和体重的增加而降低 ,加强免疫后 ,对照组未能全部致死 (死亡 4 0 % ) ,而免疫组全部存活 ;攻毒后免疫组比对照组排菌时间显著缩短 (2 4h/ 2 16h)。两次口服免疫后血清IgG抗体效价达 1∶16 0 0。被动免疫保护率 10 0 %。结论　该突变株通过口服接种能够引起特异性免疫应答反应 ,具有良好的免疫原性和免疫保护作用     

抗李斯特氏菌溶血素单克隆抗体制备及检测LMO的初步应用

目的制备抗李氏溶血素单克隆(LLO)抗体,初步应用单克隆抗体检测LMO。方法以重组LLO为免疫原,以天然LLO为筛选蛋白,通过淋巴细胞杂交瘤技术,制备抗LLO单克隆抗体;以ELISA、Westernblot等方法对单克隆抗体进行鉴定;以阻断ELISA法进行检测LMO的探索。结果获得了1株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C4,经鉴定此单抗为IgG1型,属κ链抗体,杂交瘤细胞染色体数目在85～103。ELISA和Westernblot实验表明此单抗对LLO有较好的结合能力,对其他菌分泌的溶血素则无特异结合能力,用阻断ELISA检测LMO的检测时间和最低检测菌数分别为增菌后5h和9.5×105个/mL。结论研制了一株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,初步建立了阻断ELISA检测LMO的方法。