中国旱獭α干扰素家族基因的克隆及序列分析

目的 克隆中国旱獭α干扰素（IFN-α）家族基因，以期利用克隆的中国旱獭家族IFN-α在动物模型上探索慢性乙型肝炎有效的干扰素治疗方案和策略。方法 利用分子克隆技术对中国旱獭IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型、系统发生树分析、同源性比较及理化特性分析。结果从112个中国旱獭IFN-α基因克隆中获得18个独立的不重复序列，其中的14个序列来自4次以上相对独立的PCR产物，将它们分为14个基因亚型，其中8个是功能基因亚型，6个是假基因亚型。中国旱獭IFN-α各基因亚型之间在核苷酸水平和氨基酸水平有很高的同源性，平均分别为93％和85％，前体蛋白N端含23个氨基酸的疏水性信号肽。结论 中国旱獭巧IFN-α家族至少有14个基因亚型，这些基因的克隆可能应用于中国旱獭HBV动物感染模型，进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略。     

土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

重组酵母鸡α干扰素的研制及其抗病毒活性测定

目的通过酵母真核表达系统获得鸡α干扰素,并鉴定其抗病毒生物活性.方法以Con A刺激4～10小时后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出鸡α干扰素成熟蛋白基因,通过EcoR I 和Xba I两个酶切位点使该基因插入酵母表达载体(pPICZa-A),并把线性化该重组酵母鸡α干扰素载体,通过电转化使鸡α干扰素基因整和到酵母(X33)基因组上,利用微量病变抑制法测定表达的鸡α干扰素的抗病毒活性.结果实验结果表明重组酵母鸡α干扰素活性单位为10×48U/ml,具有较好的抗病毒效果.结论实验研究结果表明重组酵母鸡α干扰素具有较好的抗病毒能力.     

猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析

目的对猫突触核蛋白(α-synuclein)进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21(DE3),获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41~54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。     

牛奶主要过敏原α_(s1)-酪蛋白全长与片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆并表达牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白的全长及N端、C端两个片段区基因,用于筛选与制备牛奶主要过敏原的单克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术克隆αs1-酪蛋白基因,测序后将目的片段克隆入原核表达质粒pET载体,转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,获得重组αs1-酪蛋白。用Ni2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELISA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性。结果:克隆获得αs1-酪蛋白全长的开放阅读框基因为645bp(含终止密码子),编码214个氨基酸。N、C端片段区基因(含终止密码子)分别为285、294bp,编码94、97个氨基酸。三种重组蛋白均能以可溶性表达形式纯化,经Western blot和ELISA检测都具有较好的免疫原性,而αs1-酪蛋白全长的免疫原性更强。结论:成功地克隆和表达了αs1-酪蛋白全长及N、C端两个片段区基因,为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体,制备牛奶主要过敏原的检测试剂奠定了基础。     

趋化因子MIP-3α的克隆与表达

目的 克隆人趋化因子MIP-3α基因，表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。方法从扁桃体中提取总RNA，再进行RT-PCR，扩增MIP-3a成熟蛋白基因，并在5’和3’分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上，转化E．coli．DH5α，筛选阳性克隆，酶切鉴定，DNA测序检测插入序列的正确性，缺失突变获得MIP-3α天然蛋白表达载体pET32a( )／MIP-3α，SDS-PAGE分析其表达，Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。结果 成功克隆了MIP-3α基因，表达并初步纯化得到MIP-3α融合蛋白。结论构建的MIP-3α硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达MIP-3α硫氧还蛋白。     

鸭子α-干扰素基因表达及多样性分析

目的：采用分子杂交及ＰＣＲ方法，分析鸭α－干扰素基因的表达及多态性。方法：从鸭外周血分离出的单核细胞在体外经ＰＨＡ（５ｕｇ／ｍｌ）刺激不同时间后，提取总ＲＮＡ。以ＲＴ－ＰＣＲ方法检测鸭α－干扰素（ＤｕＩＦＮ－α）ｍＲＮＡ表达状况。引物根据最近公布的ＤｕＩＦＮ－α基因序列设计。从鸭外周血单核细胞中提取的基因组ＤＮＡ经限制性内切酶ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄⅢ，ＰｓｔＩ，ＸｂａＩ消化后，以公布的ＤｕＩＦＮ－α序列为探针，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析ＤｕＩＦＮ－α基因的多样性。结果：在未经ＰＨＡ刺激的鸭外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）中，未检测到ＤｕＩＦＮ－α表达；ＰＨＡ刺激４ｈ后，即可检测到ＤｕＩＦＮ－α表达，一直持续到２４ｈ，基因组ＤＮＡ限制性内切酶多态性分析表明，ＰｓｔＩ酶切后，出现片段大小各异的杂交信号，提示ＤｕＩＦＮ－     

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。     

小鼠γ—干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的 克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因，构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒。方法 从BALB／c小鼠脾脏提取总RNA，用RT—PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因，分别用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-)，定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1(-)，构建成真核表达质粒pcDNA3．1(-)γ-IFN，转化产物通过PCR扩增筛选，双酶切鉴定；阳性克隆进行序列分析。结果 RT—PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段，PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段；阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确。结论 成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒，为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础。     

应用噬菌体随机肽库技术研究干扰素-α2b抗原表位

目的应用噬菌体随机肽库技术，研究干扰素-α2b高抗原性表位。方法利用结合有干扰素-α2b多克隆抗体的免疫磁性微球，对噬菌体随机肽库进行生物淘筛，以ELISA方法鉴定阳性克隆。阳性克隆测序后与干扰素氨基酸序列进行了同源性分析，研究干扰素-α2b分子中高抗原性表位。结果经4轮淘筛后噬菌体克隆的阳性率为57．6％，据随机挑选的12个阳性克隆的同源性分析结果将其分为3组，分别对应干扰素-α2b 3个高抗原性表位与预测的结果吻合，其中第2组与干扰素受体结合区AB环接近。结论利用噬菌体随机肽库技术，成功筛选出3个与抗原性预测相符合的干扰素-α2b抗原表位，为研究干扰素分子的作用机理、制备抗特定表位的单克隆抗体以及设计和开发干扰素的小分子模拟肽奠定了基础。     

干扰素的免疫调节作用

干扰素是由有关生物细胞在干扰素诱生剂作用下产生的一类诱生蛋白。国际干扰素命名委员会将其分为三种:α干扰素(IFN-α)、β干扰素(1FN-β)和γ-干扰素(1FN-γ)。根据氨基酸顺序的不同,又分为若干亚型:人α-干扰素至少有20个亚型,β干扰素有4个亚型,γ-干扰素可能也有4个亚型。     

可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达

目的构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE。方法将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE。将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVKHBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案。     

超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定

目的 构建SEA(D227A)基因的原核表达载体，并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使SEA基因第680位碱基由A突变为C，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由天冬氨酸(GAT)突变为丙氨酸(GCr)，构建pGEX-SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌DHSa中原核表达，再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致；成功地构建pGDX-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，通过IPTG诱导、GSTrap FF柱分离纯化及凝血酶切除CST后，得到Mr为27000的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示，100ng/mL重组SEA(D227A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，所得重组SEA(D227A)能够刺激淋巴细胞增殖，但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。     

通过酵母分泌人干扰素

通过建构质粒在酵母菌(saceharomyces cerevisiae)内直接合成干扰素(IFN)α1,α2和γ,这种干扰素表达基因包括含有分泌信号编码序列能在培养液中分泌活性干扰素。从酵母细胞培养液内分离获得的大部分IFN α1,α2,与天然成熟干扰素具有相同的氨基末端,揭示这种移动的信号序列类似人细胞的信号序列.以上结果说明,低等真核生     

小鼠GV卵中母源基因的克隆和其中一个基因在植入前胚表达的研究

目的 克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(GV卵)中母源基因，并检测其中一个基因在植入前不同发育阶段胚中的表达，初步了解该基因在卵母细胞发育成熟及早期胚发育中的作用。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)，以生发泡完整的卵母细胞为检测子(tester)，8-细胞胚为驱赶子(driver)，建立GV卵中母源基因的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选GV卵中母源基因的cDNA文库，对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；并采用RT-PCR方法观察其中1个阳性克隆的基因在着床前胚的表达。结果 克隆得到18个基因的cDNA序列和8个同源EST序列在GV卵中特异表达，包括PeroxiredoxinⅡ基因。RT-PCR显示PeroxiredoxinⅡ基因呈阶段性差异表达，在GV卵、MⅡ卵、1-胞胚和2-细胞胚有表达，但从MⅡ卵开始表达下降。而在4-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚和囊胚中不表达。结论 PeroxiredoxinⅡ基因是GV卵中母源基因cDNA文库中的一个基因，提示该基因在卵母细胞发育成熟和合子基因激活中起一定作用。     

异位表达的鸭白蛋白下调鸡DF-1细胞IFN-β和Mx1 mRNA的表达

目的研究白蛋白(ALB)基因对β-干扰素(IFN-β)和黏病毒抗性蛋白1(Mx1)mRNA表达的影响。方法本实验将鸭ALB基因亚克隆入pEGFP-C1真核表达载体,并通过脂质体法转染DF-1鸡成纤维细胞。24 h后,用聚肌胞苷酸(PolyI∶C)刺激,荧光定量PCR检测IFN-β和Mx1的mRNA的表达的动态变化情况。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-ALB,并有效的转染入DF-1细胞。PolyI∶C刺激12 h后,ALB组中IFN-β和Mx1基因的表达量显著低于EGFP组(P0.05,P0.01)。结论过表达鸭ALB基因下调DF-1细胞IFN-β和Mx1 mRNA的表达。     

人干扰素基因植物表达载体的构建及其在人参愈伤组织细胞中的表达

目的：利用组织培养人参愈伤组织细胞表达人干扰素，探讨用植物细胞表达人类基因的可行性。方法：用PCR从pBV889扩增人干扰素α2b（hIFN-α2b）编码基因，将其克隆于pMD18-T载体和pBI121，进而构建植物细胞表达载体pBIFN。用冻融法将pBIFN导入根瘤农杆菌LBA4404，经卡那霉素和利福霉素筛选后利用农杆菌介导的转化法将hIFN-α2b基因导入人参愈伤组织细胞。经G418筛选，形成阳性细胞。用PCR、RT—PCR、Western blot和WISH／VSV系统检测转基因组织。结果：经PCR检测表明hIFN-α2b基因已成功整合到人参愈伤组织细胞基因组中。RT-PCR证明存在hIFN-α2b基因的转录产物。Western blot分析表明转基因人参愈伤组织细胞能有效表达hIFN-α2b蛋白。WISH／VSV系统检测分析表明表达的hIFN-α2b具有生物学活性。结论：本研究利用转基因人参愈伤组织细胞成功地表达了人干扰素，为进一步提高口服干扰素的疗效打下基础。     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

小鼠γ-干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因,构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒.方法从BALB/c小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因, 分别用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-),定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建成真核表达质粒pcDNA3.1(-)γ-IFN.转化产物通过PCR扩增筛选,双酶切鉴定;阳性克隆进行序列分析.结果 RT-PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段.PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段;阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确.结论成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒,为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础.     

伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达

根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAPp15)基因及其3′非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因。克隆片段长273bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa。经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%。抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋。将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达。重组融合蛋白大小为35kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白。