腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA抑制肺癌A-549细胞的实验研究

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ODC）和S－腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC）双反义重组腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）介导的ODC和AdoMetDC反义RNA对肺癌A 549细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法：采用FACS检测Ad-GFP感染细胞中GFP表达,以测定不同MOI的腺病毒对肺癌A-549细胞的基因转染效率;应用MTT法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖的影响;采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒对肺癌A-549细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,并应用TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞凋亡的影响。结果：基因转染效率结果显示,以50 MOI的Ad-GFP感染肺癌细胞48h后,大约有75% 肺癌A-549细胞GFP表达阳性;Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖有明显抑制作用。Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制肺癌细胞中ODC和AdoMetDC基因表达 ,基因抑制率大于60％（P＜0.05）。HPLC结果显示,肺癌A-549细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内三种多胺含量都明显降低（P＜0.05）。TUNEL标记检测结果证实,Ad-ODC-AdoMetDCas可引起肺癌A-549细胞明显凋亡。结论：ODC和AdoMetDC双反义腺病毒具有显著抑制肺癌增殖和侵袭的作用,对于肺癌的防治研究具有一定的意义,有望成为治疗肺癌的基因药物。     

人鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)第三外显子和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)翻译起始位点双反义RNA腺病毒载体。方法：应用RT-PCR方法扩增出SAMDC mRNA翻译起始位点区205 bp的基因片断。插入PMD-18T载体中．经XbaI、XhoI酶切回收,反向插入穿梭质粒pAdTrack-CMV-ODCr,形成重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr。经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-ODC-SAMDCr,经PacI酶切后,转染293细胞,包装出腺病毒颗粒．经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：利用RT-PCR方法成功地从大肠癌细胞扩增出205bp的cDNA片断,经测序证实为SAMDC翻译起始位点序列。测序证实,重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr两个基因插入方向和序列均正确．转入Adeasy-1细菌获得多个阳性重组克隆。pAdeasy-ODC-SAMDCr转染293细胞进行包装扩增．可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达．PCR法证实含有目的基因。结论：成功构建并扩增出ODC和SAMDC双反义RNA腺病毒载体．为以后肿瘤的基因治疗和预防研究提供了必要工具。     

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法：RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段，插入pMDl8-T载体中，经SalⅠ、BglⅡ酶切，插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经Pme Ⅰ酶切线性化后，转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经Pac I酶切后，转染293细胞包装成腺病毒颗粒，经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段，经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODC。转入pAdesy-l细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODC。转染293细胞进行包装，经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论：成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体，为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体对食管癌细胞凋亡的影响

目的探讨ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响。方法应用MTT法实验观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响;采用Western印迹和HPLC分别检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,同时应用原位末端标记（TUNEL）法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响,应用透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果应用MTT法实验表明,Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用（P<0.05）。以Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达（P<0.05）。HPLC结果显示,食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内三种多胺含量均明显降低（P<0.05）。TUNEL标记检测结果显示,Ad-ODC-AdoMetDCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡（P<0.05）,透射电镜下可见典型的细胞凋亡特征,表现为细胞体积缩小,核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集等。结论ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体能显著抑制食管癌细胞生长增殖,降低细胞多胺合成,促进细胞凋亡,为探讨食管癌基因治疗的可行性提供了实验依据。     

CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建趋化因子受体CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组载体并获取重组腺病毒以用于抗HIV-1基因治疗的研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中分别扩增出趋化因子受体CCR5,CXCR45′端翻译起始区653bp和636bp的cDNA片段,将其反向插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV中,再与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌同源重组,卡那抗性培养基筛选阳性克隆;同源重组的载体用脂质体转染剂转染293细胞包装、扩增,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)以及PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒.结果:成功构建了CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体,并于293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒,其滴度为:7.2×1012PFU/mL.结论:CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒的构建为研究双靶位辅助受体反义RNA抗HIV-1的作用打下基础.     

人ODC基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的RNAi慢病毒载体。方法:根据ODC mRNA序列, 选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火后插入pSuper载体的H1RNA启动子后产生pRiODC,将其中的ODC shRNA表达结构酶切插入慢病毒转移质粒pHR' CMVGFP,产生pHRiODC/GFP。与△R8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒,分别采用转导HEK293T细胞和Real-Time RT-PCR的方法测定慢病毒的功能滴度和病毒RNA分子拷贝数。结果:酶切和测序证实,pRiODC质粒构建正确,产生能同时表达GFP和转录产生ODC shRNA的慢病毒转移质粒PHRiODC/GFP,未浓缩及浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.3×104 TU/ml和7×106TU/ml, RNA拷贝数分别为3.4×108copies/ml和3.6×1010copies/ml。结论:成功构建人ODC基因RNAi慢病毒载体,为通过阻断ODC基因表达治疗恶性肿瘤奠定了基础。     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的 构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体，探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法 用DNA直接克隆连接的方法，构建反义Smad3腺病毒重组质粒，再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后，感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录。结果 经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功，RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达。结论 所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达，可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究。     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体,探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性.方法用DNA直接克隆连接的方法,构建反义Smad3腺病毒重组质粒,再用293细胞包装.重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞, RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录.结果经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达.结论所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达,可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究.     

腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用

目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础.     

人前列腺特异性膜抗原胞外区基因重组腺病毒的构建

目的:体外构建和表达人前列腺特异性膜抗原胞外区(tPSMA)基因重组腺病毒。方法:首先设计一对含BglⅡ和HindⅢ酶切位点的tPSMA引物,以质粒pCR3.1-Uni-hPSMA为模板,通过PCR扩增tPSMA并克隆到腺病毒穿梭质粒中,获得pAdTrack-CMV-tPSMA质粒,将其与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选阳性克隆,重组子经线性化后转染HEK293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、RT-PCR、Western blot法检测目的基因tPSMA的表达。结果:成功构建了含tPSMA的重组腺病毒载体Ad-tPSMA,病毒滴度为2.0×1011pfu/L。结论:该重组腺病毒的构建为下一步研究用其制备树突状细胞疫苗基因治疗提供基础。     

人p27~(kipl)可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kipl可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响。方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kipl cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kipl基因腺病毒(Ad-p27kipl),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化。Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照。结果:构建的Ad-p27kipl病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用。结论:体外连接法成功地构建携带人p27kipl基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用。     

Adenovirus Mediated BIMS Transfer Induces Growth Supression and Apoptosis in Raji Lymphoma Cells

Objective To transfer pro-apoptotic BIM directly into tumor cells bypass the complicated biologica processes of BIM activation so as to reverse the chemoresistance of cancer cells. Methods BIMS was specifically amplified from HL-60 cells by RT-PCR, confirmed to be correct by sequencing and cloned into shuttle vector pAdTrack-CMV carrying a green fluorescence protein gene to generate a recombinant plasmid pAdTrack-CMV-BIMS. This plasmid and adenovirus backbone plasmid pAdEasy-1 were linearized and electroporated into E.coli BJ5183 host bacteria to mediate homologous recombination. The positive clone was identified by restrict endonuclease digestion. The recombinant pAdEasy-CMV-BIMS was transferred into HEK293 cells for packaging and amplification. The successful construction of recombinant human BIMS adenovirus （Ad-BIMS） was demonstrated by Western blot. To test whether Ad-BIMS has the capability of inducing apoptosis of tumor cells, Ad-BIMS was used to infect GC resistant Burkitt lymphoma Raji cells. Results After infected for 2-5 days, BIMS expression in Raji cells was detected by RT-PCR and Western blot. The significant growth retardation and apoptosis of Raji cells were also observed by MTI- and flow cytometry. Conclusion These results indicated that BIMS might be a potential candidate of gene therapy for chemoresistant tumor cells.     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

胰岛素样生长因子-1与血小板源生长因子-AA以及肿瘤生长因子β1基因克隆及其在腺病毒载体中的表达

目的 从正常的人体成骨细胞中克隆IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1三因子的编码蛋白基因,构建上述因子基因的高效表达重组腺病毒,旨在为基因治疗研究提供有效的工具。方法 培养正常人体成骨细胞,提取细胞总RNA,RT—PCR方法获得IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1的编码基因。将这些片段克隆到高效表达腺病毒载体Adeno—X,并经过HEK293细胞的包装,获得成熟的重组腺病毒。Western印迹法检测上述三因子的表达。利用成熟重组腺病毒感染成骨细胞,检测细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的改变。结果 重组T载体、重组腺病毒DNA和成熟的重组腺病毒体中均可得到IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1基因的PCR片段。Western印迹检测到上述3种因子蛋白质的表达。当携带上述3种因子的重组腺病毒感染成骨细胞后,细胞增殖明显增强,ALP活性明显提高。结论 本实验构建的IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1因子的高效表达重组腺病毒可以在人体细胞中表达出具有生物活性的蛋白质,获得了较好的基因工具。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…