日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

人真核翻译起始因子3C基因的克隆及表达

【摘要】 目的 构建人真核翻译起始因子3C（Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 Subunit C, EIF3C）编码区全长的真核表达载体,转染FaDu人下咽鳞癌细胞系,为探讨EIF3C的生物学功能奠定基础。方法 从人下咽鳞癌细胞系中提取总RNA,反转录成cDNA后用特异性引物PCR扩增EIF3C基因编码区全长（NM_0010378082）,双酶切后将EIF3C基因编码区全长克隆到载体pCMV Blank上,构建真核表达载体pCMV EIF3C。转染FaDu细胞系,real timePCR和Western blot检测EIF3C表达水平。将未加质粒转染FaDu细胞作为未加质粒转染组,加质粒pCMV Blank作为pCMV Blank转染组,以及加质粒pCMV EIF3C作为pCMV EIF3C转染组。分别将pCMV EIF3C转染组EIF3C的mRNA和蛋白表达水平与未加质粒转染组、pCMV Blank转染组进行比较,以及比较未加质粒转染组和pCMV-Blank转染组。通过生物信息学网站和软件分析人EIF3C氨基酸序列的理化性质、磷酸化位点、二级结构和三维结构。结果 测序结果表明构建的真核表达载体pCMV EIF3C中人EIF3C序列正确。转染实验表明载体pCMV EIF3C转染组EIF3C的mRNA水平相比载体pCMV Blank转染组升高708倍,未加质粒转染组升高802倍（P＜0.001）,且载体pCMV EIF3C转染组蛋白表达水平相比于载体pCMV Blank转染组和未加质粒转染组也显著升高（P＜0.05）。EIF3C蛋白质由913 个氨基酸组成,预测含有27个磷酸化位点,其二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。结论 成功构建真核表达载体pCMV EIF3C,并使EIF3C在下咽鳞癌细胞系中过表达。     

抗日本血吸虫病天然分子疫苗免疫猪血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库结果分析

目的通过天然分子疫苗免疫猪血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,应用表达序列标签获得日本血吸虫新基因.方法制备天然分子免疫猪血清,将筛选的尾蚴cDNA文库中大肠杆菌XL1-Blue侵入大肠杆菌BM25.8后环化成质粒,筛选出已转入质粒的菌株.提取质粒DNA,进行测序,得到一个表达序列标签(EST).通过NCBI网站的BLASTx及BLASTn公共数据库,编辑分析EST序列并进行同源性比较.结果从26个克隆样品中筛选出8个阳性克隆,其中有一个新基因(GenBank登录号DQ097517),该基因全长861 bp,有完整的阅读框架,与蜜蜂(Apis mellifera)SMC3蛋白编码的mRNA基因序列同源性最高.结论疫苗免疫猪血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针,新发现1个日本血吸虫相关基因.     

红藻氨酸致痫大鼠海马神经元中真核生物起始因子2α酶切片段的产生

目的：研究半胱氨酸一天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)在红藻氨酸癫痫模型大鼠海马凋亡神经元中，对其已知底物真核生物起始因子2(eIF2α)的作用。方法：制备红藻氨酸诱导大鼠癫痫模型，记录模型发作行为及脑电图表现，以TUNEL法检测模型癫痫发作终止后12、24、48、72和96h海马神经元凋亡情况，同时以Westerm blot法检测模型鼠海马eIF2α的表达变化及其与细胞凋亡之间的相关性。结果：在癫痫发作后12h出现凋亡神经元，随时间延长，海马神经元凋亡数不断增加，72h达高峰；发作后24h海马神经元出现了Caspase-3酶切eIF2α产生的片段，并逐渐变浓，至72h。结论：癫痫模型大鼠海马中caspase-3酶切eIF2α与神经元凋亡的发生时间一致，提示在癫痫模型大鼠海马神经元凋亡中eIF2α被Caspase-3酶切。     

蛋白翻译起始因子C2在原发性肝细胞肝癌中表达的意义

目的：研究C2 mRNA及其蛋白在原发性肝细胞肝癌（HCC）中的表达及意义。方法：用原位杂交检测C2 mRNA在21例HCC及其癌旁组织中的表达,ABC免疫组化法检测C2蛋白60例HCC及其42例癌旁组织中的表达,Western blot检测C2蛋白在HCC及其癌旁组织中的表达。结果：21例HCC及其癌旁组织中,C2 mRNA阳性率分别占23.8%（5/21）和85.7%(18/21)。60例HCC及42例癌旁组织中,C2蛋白阳性分别占27.3%(17/60)和83.3%（35/42）。27例肝硬变中,C2蛋白阳性率为77.8%(21/27)。χ^2检验：C2 mRNA及其蛋白在HCC癌旁组织中表达明显高于癌组织（P＜0.001);C2蛋白在肝硬变中的表达明显高于HCC癌组织（P＜0.001);C2的表达与患年龄、HBsAg及AFP有明显关系（P＜0.001);碉与癌组织的分化程度、肿瘤大小、淋巴转移无并;Western bolt与免疫组化结果一致。结论：C2基因表达下调可能与HCC的发生、发展及早期诊断。     

日本血吸虫（大陆株）成虫基因表达谱的研究

报告作1998年至2000年有关日本血吸虫（大陆株）成早基因表达谱研究的结果，主要扬：已测定551条EST，其中519条EST已送入国际基因数据库（GenBank/dbEST），并获得了GenBank的登录号。经同源整合后，519长EST序列归类为388个基因序列，其中，24条（6.19％）为日本血吸虫已知基因序列；18条（4.64％）EST与曼长血吸虫已知基因序列同源，90条（23.19％）EST与其它生物的已知基因序列同源，同源基因包括精氮酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的256条（65.98％）EST在Gen-Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因/未知基因序列EST，共364条。已克降日本血吸虫精氮酸酶基因、Y-盒结合蛋白基因和抗凋亡-1因子3个新基因的全长cDNA，其GenBank的登录号分别为AF402615、AF367371和AF333765。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据，并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠磷酸化真核翻译起始因子2α和激活转录因子4表达的变化

目的:了解新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后磷酸化真核翻译起始因子2α[eIF2α(p)]?激活转录因子4(ATF4)表达的变化?方法:7日龄新生SD大鼠80只,随机分为2组:假手术组和HIBD组,每组各40只?HIBD组采用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型,分别于缺氧缺血(HI)后6?12?24和72 h取其脑组织切片,采用免疫组织化学方法检测病变侧大脑皮质eIF2α(p)?ATF4蛋白的表达?假手术组不行缺氧缺血处理,采用同样方法检测其eIF2α(p)?ATF4蛋白的表达?结果:假手术组eIF2α(p)?ATF4蛋白少量表达,各时间点无明显变化(P > 0.05);HIBD组6 h可以观察到较多eIF2α(p)?ATF4蛋白,12 h达到高峰,72 h明显减少,但仍高于假手术组?HIBD组与假手术组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)?HIBD组各时间点比较,差异有统计学意义(P < 0.01)?结论:eIF2α(p)?ATF4参与了新生大鼠HIBD病理生理过程?HIBD可能诱发了内质网应激反应,启动了PKR样内质网激酶(PERK)介导的未折叠蛋白应答(UPR)通路?     

日本血吸虫尾蚴（中国大陆株）表达序列标签的获取及同源性分析

目的：了解日本血吸虫尾蚴cDNA文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法：日本血吸虫尾蚴cDNA文库中的噬菌体侵入大肠杆菌BM25．8后环化成质粒。筛选出转入质粒的菌株。提取质粒DNA,用质粒上的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（EST0。通过BLASTx及BLASTn公共数据库经编辑分析的EST序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新EST序列,以编写好的程序和E-mail方式递交,以获得GenBank登录号,通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论：在测出的58个EST中有3个核苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有2个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有7个EST的蛋白质序列与其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有27个EST的蛋白质核苷酸序列同源性都很低。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

真核翻译起始因子eIF3A导致的翻译起始异常和相关疾病

真核生物翻译控制在细胞进程中对基因表达调控具有重要作用,能确保蛋白的迅速调节以维持细胞内稳 态。真核翻译是一个多步骤的过程,包括起始、延伸、终止和核糖体循环,其中起始是限速步骤,受真核翻译起始 因子(eukaryotic translation initiation factors,eIFs)调控。翻译起始缺陷将导致一系列疾病。在所有eIFs中,eIF3是最大的 同时知之较少的因子。eIF3A是eIF3因子的最大亚基,其异常一方面会导致肿瘤发生,另一方面将阻止肿瘤向更高级 别恶性肿瘤进展。eIF3A表达变化和突变影响肿瘤患者对铂类化疗药物的反应。此外,eIF3A与纤维化病变相关,抑 制eIF3A的试剂能延缓病变进展。eIF3A在肿瘤中的双重作用可能是其在肿瘤进展的不同阶段调节不同mRNAs翻译的 结果,特定阶段不同mRNAs的编码产物发挥促癌或抑癌作用。     

人类新基因eola1全长cDNA序列的克隆

人类基因组计划完成后 ,功能基因和蛋白质组的研究成为当今生命科学研究的热点[1] 。克隆差异表达基因对于深入理解基因功能及阐明重大疾病的发病机制都有极其重要的意义。本文报道了我们最近应用抑制消减杂交 (ＳＳＨ) [2 ] 和ｃＤＮＡ末端扩增技术 (ＲＡＣＥ) [3 ] 从内毒素 (ＬＰＳ)刺激后人脐静脉内皮细胞中克隆一个人类新基因ｅｏｌａ1全长ｃＤＮＡ序列。1　材料和方法1.1　细胞培养和ＬＰＳ处理　　培养人脐静脉内皮细胞系ＥＣＶ3 0 4,分成ＬＰＳ处理组和对照组。ＬＰＳ处理系在培养基中加入ＬＰＳ(0 111∶Ｂ4,10 0ｎｇ/ｍｌ)刺激6ｈ…     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

结肠腺癌中eIF2c的表达及与细胞凋亡的关系

目的:检测结肠腺癌组织中真核翻译起始因子2c(eukaryotic translation initiation factor 2c,eIF2c)的表达,分析其与细胞凋亡的关系.方法:以69例结肠腺癌患者为研究对象,留取肿瘤组织为观察组,留取正常结肠黏膜组织为对照组.应用免疫组化法检测eIF2c、半胱氨酸肽酶-3(Ca...     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

Relationship between Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E and Malignant Angiogenesis in Non-Hodgkin Lymphoma

The relationship between angiogenesis and eukaryotic translation initiation factor 4E （EIF4E） expression level in non Hodgkin lymphoma （NHL） was studied. Mean microvessel density （MVD） and EIF4E were detected in 52 lymph node samples paraffin sections of patients with newly diagnosed NHL by the way of immunohistochemistry. Antisense EIF4E cDNA was cloned into plasmid pcDNA3.1 （＋） and transfected into Raji cells. A series of angiogenesis related factors,including vascular endothelial growth factor （VEGF）, matrix metalloproteinases 9 （MMP-9） and tissue inhibitor of metalloproteinases-2 （TIMP-2） proteins were detected by Western blot. The results showed that： （1） The Expression of EIF4E and MVD was higher in aggressive lymphomas than in indolent lymphomas（P〈0.05）and the expression of EIF4E was positively correlated with MVD in lymph node of NHL（r=0. 695, P〈0.01）. （2） Antisense EIF4E eukaryocytic expression vector （pcDNA3. 1-EIF4Eas） was constructed successfully. （3） EIF4E, VEGF and MMP-9 were expressed at high levels in Raji cells as compared to normal human peripheral blood monocular cells （NHPMC）, and blockage of EIF4E expression brought down the expression of VEGF and MMP-9. However, TIMP-2 was undetectable in Rail cells, although a moderate level of TIMP-2 was detected in NHPMC. It was concluded that the increased EIF4E expression was associated with aggressive property of NHL.