糖基化终产物受体在大鼠牙周膜成纤维细胞中的表达

目的研究体外培养大鼠牙周膜成纤维细胞在糖基化终产物诱导下糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)的表达情况。方法收集第三代体外培养的大鼠牙周膜成纤维细胞,在含有终浓度为50、100、200 mg/L的糖基化牛血清白蛋白、200 mg/L的牛血清白蛋白以及不含上述蛋白成分培养基内孵育48 h,分别设为A组、B组、C组、D组、E组。免疫组织化学法、反转录-聚合酶链反应(reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞内RAGE蛋白及mRNA表达。结果免疫组织化学结果显示A、B、C组中牙周膜成纤维细胞内RAGE蛋白表达均为阳性,且随浓度增高,表达强度略有增强,而D及E组无表达;RT-PCR检测发现A、B、C组RAGE mRNA均表达且表达强度随浓度增高而增强,D组有少量表达,E组不表达。结论体外培养的牙周膜成纤维细胞在糖基化终产物诱导下能够表达RAGE。     

糖基化终产物对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨糖基化终产物在糖尿病牙周病形成中的作用。方法：原代培养牙周膜成纤维细胞,将糖基化终产物修饰的人血清白蛋白及未修饰人血清白蛋白与牙周膜成纤维细胞在体外共同培养,MTT法测定细胞增殖,用碱性磷酸酶测定法测定ALP。结果：糖基化终产物修饰的人血清白蛋白能以浓度依赖的方式抑制牙周膜细胞的增殖（p〈0.05）,而未修饰人血清白蛋白可使细胞增殖,但两种白蛋白均不诱导ALP的表达。结论：糖基化终产物可通过抑制牙周膜成纤维细胞的增殖,降低糖尿病病人牙周组织对损伤的修复能力,导致牙周病。     

凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在晚期糖基化终产物诱导人牙龈成纤维细胞凋亡中的作用

目的 观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGF)凋亡的诱导作用,同时通过检测胱天蛋白酶(caspase)-8,9,3酶活性改变及caspase抑制剂对凋亡作用的影响,探讨凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在AGE诱导HGF凋亡过程中的作用.方法 将AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-human serum albumin,AGE-HAS)与HGF共培养(以不加AGE-HAS的HGF为空白对照组),利用酶标仪分别测定12、24h后caspase-8,9,3酶活性的变化;分别添加caspase-8,9,3及caspase-8 +caspase-9抑制剂后(分别为caspase-8,9,3及caspase-8+ caspase-9抑制剂组,不添加caspase抑制剂的为阳性对照组),检测24h后Hoechst33258染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染检测细胞凋亡率,酶标仪测定caspase-3酶活性的变化.结果 caspase酶活性检测结果表明:HGF与AGE-HAS共培养后,caspase-8,9,3的酶活性分别为0.1097±0.0051、0.0965±0.0051及0.1280±0.0103,共培养24h后酶活性分别为0.1558±0.0053、0.1308±0.0035及0.1954±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33258染色结果显示caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组、caspase-3抑制剂组阳性细胞数分别为(247.7±32.4)、(200.1±14.6)、(154.1±14.4)及(131.3±14.6)个,与阳性对照组[ (350.4±20.0)个]间差异均有统计学意义(P＜0.05);膜联蛋白V-碘化丙啶双染结果显示,caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组及caspase-3抑制剂组凋亡率分别为(38.87±3.31)％、( 25.57±2.20)％、(17.17±2.24)％和(14.73±2.48)％,与空白对照组及阳性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);caspase-3酶活性在caspase-8、caspase-9及caspase-8+caspase-9抑制剂组分别为0.1274±0.0076、0.1465±0.0062、0.1044±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 AGE-HAS主要通过激活caspase依赖性凋亡途径诱导HGF凋亡;其中死亡受体途径可能在凋亡过程中占主导地位.     

尼古丁诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的实验研究

目的：了解在体外培养环境中,尼古丁对人牙周膜成纤维细胞凋亡的影响。方法：将尼古丁作用于培养至第6代的人牙周膜成纤维细胞后,通过四唑盐比色法、流式细胞仪研究尼古丁能否诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡。结果：四唑盐比色法证实当尼古丁浓度在0.05～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的抑制呈浓度依赖性,流式细胞仪分析提示,当尼古丁浓度在0.5～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的凋亡率呈浓度依赖性。结论：尼古丁对人牙周膜成纤维细胞有一定的毒性作用,通过抑制牙周膜成纤维细胞增殖和诱导凋亡加重对周膜的破坏。     

糖基化终产物促进人牙龈成纤维细胞凋亡机制及葛根素拮抗作用初探

目的 观察糖基化终产物(advanced glycation end-products,AGE)对人牙龈成纤维细胞凋亡及活性氧生成的影响,探讨AGE在糖尿病加重牙周病变中的作用机制.方法 分别采用3组不同质量浓度(0、50、150 mg/L)的AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-human serum albumin,AGE-HSA)与人牙龈成纤维细胞共培养,利用流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧水平变化;50 mg/L AGE-HAS质量浓度组加入0.24 mmol/L葛根素共培养(葛根素实验组)后检测细胞凋亡率.结果 0、50、150 mg/L AGE-HAS质量浓度组凋亡率分别为(1.60±0.30)%、(29.43±1.45)%、(49.20±4.43)%,细胞凋亡率随刺激物质量浓度增加逐渐升高,组间差异有统计学意义(P＜0.05),细胞荧光强度随浓度升高逐渐增强(P＜0.05);葛根素实验组凋亡率[(6.37±3.02)%]显著低于对照组[(29.43±1.45)%,P＜0.05].结论 糖基化终产物能促进人牙龈成纤维细胞凋亡,其凋亡促进作用可能由氧化应激所介导;葛根素可通过抑制这种凋亡而保护牙周组织.

Abstract：

Objective To observe the effect of synthesized advanced glycation end-products(AGE)on reactive oxygen species formation and apoptosis of the cultured human gingival fibroblast and investigate the potential mechanisms of AGE in the modification of periodontal impairment. Methods AGE products with different concentrations[0, 50, 150 mg/L AGE-human serum albumin (AGE-HSA)] were incubated with human gingival fibroblast for 48 h, respestively. Flow cytometry was used to detect intracellular reactive oxygen species and cell apoptosis. The culture media with 50 mg/L AGE-HSA was exposed to 0.24 mmol/L puerarin for 48 h and then cell apoptosis was measured. Results The values of cellular apoptotic rate in 0,50, 150 mg/L AGE-HSA groups were ( 1.60 ± 0.30 ) %, ( 29.43 ± 1.45 ) %, ( 49. 20 ± 4. 43 ) %,respectively. The differences between each AGE-HSA group and control were statistically significant ( P ＜0.05). AGE-HSA increased cell apoptosis in a dose-dependent manner ( 150 mg/L ＞ 50 mg/L ＞0 mg/L,P ＜0.05 ). The cellular fluorescence intensity value was elevated as the concentration of AGE-HSA increased ( P ＜ 0.05 ). After incubation of human gingival fibroblast with AGE-HSA for 48 h, there was a significant decrease in apoptotic rate in puerarin group [ ( 6. 37 ± 3.02 ) % ], compared with the control [ ( 29. 43 ±1.45 ) %, P ＜ 0.05 ]. Conclusions AGE can stimulate apoptosis of human gingival fibroblast, which may be mediated by oxidative stress. Puerarin may protect periodontal tissues by inhibiting the apoptosis.     

糖基化终产物对人牙周膜细胞自噬的影响

摘要 目的：研究在体外培养坏境下糖基化终产物(advanced glycation end of products,AGEs)对人牙周膜细胞(hPDLCs)发生自噬现象的影响。方法 选取因正畸治疗而拔除的前磨牙,组织块法分离培养人牙周膜细胞,鉴定后传代培养。用不同浓度的AGEs处理hPDLCs,以单纯DMEM完全培养基作为阴性对照组,培养0、1、3、6、9h,透射电镜观察细胞自噬体数量的变化和形态,Western blot、免疫荧光法检测自噬蛋白LC3表达的改变,检测在体外培养坏境下AGEs对hPDLCs发生自噬现象的影响。结果 AGEs处理hPDLFs 0、1、3、6、9 h后,与对照组比较,实验组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达显著变化;与0h比较,1h时实验组与对照组自噬水平都明显下降,随时间变化对照组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ无明显改变,实验组在3 h时达到高峰,并随时间变化逐渐降低;3 h时电镜观察和免疫荧光检测到实验组细胞胞浆内自噬体数量增加。结论 AGEs能够提高hPDLFs的自噬水平。     

咬合力改变对牙周膜成纤维细胞凋亡及其凋亡相关基因表达的影响

目的观察咬合力改变对牙周膜成纤维细胞凋亡及其相关基因表达的影响。方法拔除健康雄性SD大鼠右上颌第一、二、三磨牙建立右下颌磨牙咬合力改变动物模型,分别于拔牙后6、12h及1、2、3、5、7、14、28d处死大鼠(n=6),取右下颌磨牙区牙槽骨组织,进行H-E染色和透射电镜观察;免疫组化染色检测牙周膜成纤维细胞Bcl-2和Bax表达。另设正常咬合力大鼠作为对照组(n=6)。免疫组化染色结果采用二级计分法,根据染色强度及阳性细胞的数目进行计分取平均值。结果成功建立咬合力改变SD大鼠模型。H-E染色结果显示实验组牙周膜结构疏松,纤维排列无序,牙槽骨骨壁凹凸不平;透射电镜结果显示实验组牙周膜成纤维细胞出现核固缩、核染色质浓缩、边集。免疫组化染色表明拔牙后12h牙周膜成纤维细胞Bax表达最高(216.83±6.34),而Bcl-2的表达在3d时达峰值(219.33±10.25),此后二者均开始下降,至28d基本恢复正常(7.00±2.37,5.67±2.16,P<0.01)。结论细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax参与了牙周膜的改建过程。     

缺氧环境对牙周膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究缺氧环境对牙周膜成纤维细胞的增殖及凋亡相关蛋白表达的影响。方法采用氯化钴模拟法构建人牙周膜成纤维细胞缺氧模型。观察缺氧条件下牙周膜成纤维细胞形态变化,采用CCK-8检测细胞增殖情况,并用Western Blot方法检测凋亡相关因子p53、Bcl-2及caspase-7的表达变化。结果随着时间延长,缺氧组细胞数量减少,体积逐渐变小,细胞胞浆浓缩,细胞存活率降低。 Western Blot 结果显示缺氧组 p53、Bcl-2及caspase-7蛋白表达量随着缺氧时间延长逐渐升高。缺氧组p53蛋白、caspase-7表达高于常氧组,Bcl-2表达低于常氧组。结论缺氧环境可影响牙周膜成纤维细胞形态、增殖活性及凋亡相关蛋白的表达。     

糖基化终产物对牙龈成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的影响

目的 观察糖基化终产物对牙龈成纤维细胞增殖能力和Ⅰ型胶原合成的影响,探讨糖基化终产物对牙周组织修复功能的作用及在伴有糖尿病牙周炎中的致病机制.方法 采用组织块法培养牙龈成纤维细胞,培养基中加入体外合成的不同浓度的糖基化终产物,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测在不同时间段下牙龈成纤维细胞增殖水平的变化,酶联免疫吸附测定法和实时定量反转录聚合酶链法(RT-PCR)分别测定牙龈成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的量和表达Ⅰ型胶原mRNA的水平.结果 200 mg/L糖基化终产物作用于牙龈成纤维细胞48、74 h的A值分别为0.016±0.023、0.035±0.008,比其他组A值低(P＜0.05),并且细胞形态发生了改变,细胞由均一的梭形变成圆形、椭圆形、细长不规则条状等,胞质浓缩,细胞间隙增大;糖基化终产物作用72 h后,牙龈成纤维细胞上清液中和胞内Ⅰ型胶原的含量减少(P＜0.05),Ⅰ型胶原mRNA表达下调(P＜0.05).结论 糖基化终产物能抑制牙龈成纤维细胞的增殖、降低其合成Ⅰ型胶原蛋白和表达Ⅰ型胶原mRNA,从而可能削弱了牙周组织的愈合能力.     

尼古丁对牙周膜成纤维细胞的细胞毒性研究

目的体外研究尼古丁对牙周膜成纤维细胞（PDLFs）的细胞毒性作用,探讨尼古丁对牙周病的影响。方法用不同浓度的尼古丁作用于PDLFs,采用MTT比色法于24、48、72h测量细胞的活性：采用流式细胞仪技术于48h检测细胞周期和凋亡率。结果尼古丁抑制PDLFs细胞的生长．随着浓度的增加和时间的延长,抑制率明显增强;细胞周期分布发生了改变,G0／G1期的细胞DNA含量与正常对照组相比．明显增加．而G2期和S期则逐渐减少,同时出现了较高的凋亡率．周期阻滞及凋亡率随着浓度的递增而增加。结论尼古丁可能通过导致PDLFs细胞凋亡、抑制该细胞的增殖并使其DNA合成减少而导致牙周病的发生。     

糖基化终产物在牙周病中的作用

糖基化终产物(AGEs)是非酶性糖基化反应产生的一组异源性物质.AGEs在糖尿病患者的组织、血浆中蓄积是造成糖尿病慢性并发症原因之一.近年来亦发现AGEs与其受体作用的加强是糖尿病患者牙周病加重的发病机制之一.本文主要就AGEs及其受体在牙周病中的作用和相关机制作一概述.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

糖基化终末产物对牙周膜干细胞增殖及其Wnt经典信号通路相关基因表达的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖及其Wnt经典信号通路相关基因DKK-1、β-catenin表达的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养HPDLSC,并与100μg/mL AGEs共同培养,通过细胞克隆形成率、细胞生长曲线观察AGEs对HPDLSC增殖能力的影响;RT-PCR和Western Blot检测实验组和对照组DKK-1、β-catenin mRNA以及核蛋白β-catenin的表达量。结果:经100μg/mL AGEs刺激的HPDLSC,其克隆形成率、增殖速度以及β-catenin mRNA和核蛋白β-catenin的表达量均明显低于对照组(P<0.05);而DKK-1 mRNA则明显高于对照组(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的增殖及其Wnt经典信号通路。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

目的 探讨Wnt经典通路相关因子Dickkopf蛋白1（DKK-1）、β-链蛋白（β-catenin）在糖基化终末产物（AGEs）介导的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨分化过程中的变化。方法 通过体外组织块法和有限稀释法克隆化培养获取hPDLSCs,实验分两组：正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。对2组细胞成骨矿化诱导后行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色;实时聚合酶链反应（real time PCR）检测成骨基因,以及Wnt经典通路中相关因子DKK-1、β-catenin;Western blot检测相关成骨蛋白、细胞核蛋白β-catenin。结果 成骨诱导后,A-hPDLSCs组ALP染色明显浅于N-hPDLSCs组;茜素红染色A-hPDLSCs组钙化结节少于N-hPDLSCs组;real time PCR与Western blot的结果显示A-hPDLSCs组BSP、ALP、Runx-2的表达都较低,差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt经典信号通路中相关因子：A-hPDLSCs组β-catenin表达高于N-hPDLSCs组,A-hPDLSCs组DKK-1表达明显低于N-hPDLSCs组,并且Weston blot显示A-hPDLSCs组核蛋白β-catenin的表达高于N-hPDLSCs组。结论AGEs可以使hPDLSCs骨向分化过程中Wnt经典通路的抑制因子DKK-1下调,细胞核中的β-catenin表达升高,激活了Wnt经典通路,并且抑制了骨分化。