糖基化终产物对人牙龈成纤维细胞增殖和基质金属蛋白酶-1合成的影响

目的探讨糖基化终产物（AGEs）对人牙龈成纤维细胞（HGF）增殖和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）合成的影响,以及AGEs加重糖尿病性牙周炎的作用机制。方法采用酶消化-组织块培养法获得HGF,在培养基中加入体外合成的不同浓度AGEs,噻唑蓝（MTT）比色法检测在不同时间段下HGF增殖水平的变化;ELISA法测定HGF合成MMP-1的水平。结果各浓度组AGEs对HGF有抑制作用,呈浓度依赖关系（P〈0.05）;共培养72h后,HGF合成MMP-1量明显增加（P〈0.05）,并且随着浓度的增加而增加。结论AGEs能够抑制HGF的增殖;AGEs可以促进MMP-1合成,导致胶原降解,加速了糖尿病时牙周病进程。     

内毒素对牙龈成纤维细胞增殖活性及分泌基质金属蛋白酶的影响

目的观察内毒素对牙龈成纤维细胞增殖活性及分泌基质金属蛋白酶-1,3量的影响,探讨基质金属蛋白酶在牙周炎致病机制中的可能作用。方法通过改良酶消化组织块法进行牙龈成纤维细胞的原代培养,用内毒素对其进行刺激,运用MTT法观察内毒素对牙龈成纤维细胞增殖活性的影响,通过免疫组化法检测内毒素对牙龈成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1,3的影响。结果MTT结果显示,低浓度内毒素在短期内可以促进牙龈成纤维细胞的增殖,但随着时间的延长,也表现为对细胞的毒性作用,抑制其增殖;高浓度内毒素抑制牙龈成纤维细胞的增殖;免疫组化研究结果表明,未受LPS刺激的牙龈成纤维细胞MMP-1,3表达弱阳性,受刺激后阳性表达增强,在12h时达到顶峰,且MMP-3的整体表达较MMP-1弱。结论LPS可以影响牙龈成纤维细胞的增殖活性;LPS可以促进牙龈成纤维细胞对基质金属蛋白酶的分泌,加快牙周细胞外基质的降解,加速牙周炎的进程。     

LPS对体外培养人牙髓成纤维细胞基质金属蛋白酶抑制剂1,2 表达的影响

目的 :观察LPS对人牙髓成纤维细胞 (HDPF)表达基质金属蛋白酶抑制剂 1,2 (TIMP - 1,2 )的影响。方法 :体外培养HDPF ,用 1、10、10 0 μg/mLLPS分别刺激 2d ,采用免疫组化和图像分析法 ,观察HDPF表达TIMP - 1,2的变化。结果 :不同质量浓度的LPS对TIMP - 1,2的影响不同。与空白组相比 ,10 μg/mL的LPS刺激HDPFTIMP - 1的表达明显增加 (P <0 .0 1) ;LPS质量浓度为 10 0 μg/mL时 ,HDPF表达TIMP - 1明显减弱(P <0 .0 1)。LPS对TIMP - 2的影响呈浓度依赖关系 ;LPS质量浓度≥ 10 μg/mL时 ,TIMP - 2表达显著减弱(P <0 .0 1)。结论 :LPS通过改变牙髓成纤维细胞TIMP - 1,2的表达量 ,影响炎症过程     

糖基化终产物对人牙周膜细胞MMP-3及TIMP-1表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对人牙周膜细胞MMP-3及TIMP-1蛋白表达的影响,进一步阐明糖尿病牙周病发病过程中细胞外基质代谢调节的分子机制.方法:将糖基化终产物修饰的人血清白蛋白与人牙周膜细胞在体外共同培养,用免疫荧光法及ELISA技术检测人牙周膜细胞MMP-3、TIMP-1蛋白表达.结果:人牙周膜细胞在体外表达MMP-3,培养3d后,MMP-3表达明显增强,与对照组相比具有显著性差异.而TIMP-1表达减弱,与对照组相比不具有显著性差异.结论:糖基化终产物可显著影响人牙周膜细胞MMP-3的表达,为AGEs参与糖尿病牙周病发病机制提供了直接证据.     

凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在晚期糖基化终产物诱导人牙龈成纤维细胞凋亡中的作用

目的 观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGF)凋亡的诱导作用,同时通过检测胱天蛋白酶(caspase)-8,9,3酶活性改变及caspase抑制剂对凋亡作用的影响,探讨凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在AGE诱导HGF凋亡过程中的作用.方法 将AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-human serum albumin,AGE-HAS)与HGF共培养(以不加AGE-HAS的HGF为空白对照组),利用酶标仪分别测定12、24h后caspase-8,9,3酶活性的变化;分别添加caspase-8,9,3及caspase-8 +caspase-9抑制剂后(分别为caspase-8,9,3及caspase-8+ caspase-9抑制剂组,不添加caspase抑制剂的为阳性对照组),检测24h后Hoechst33258染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染检测细胞凋亡率,酶标仪测定caspase-3酶活性的变化.结果 caspase酶活性检测结果表明:HGF与AGE-HAS共培养后,caspase-8,9,3的酶活性分别为0.1097±0.0051、0.0965±0.0051及0.1280±0.0103,共培养24h后酶活性分别为0.1558±0.0053、0.1308±0.0035及0.1954±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33258染色结果显示caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组、caspase-3抑制剂组阳性细胞数分别为(247.7±32.4)、(200.1±14.6)、(154.1±14.4)及(131.3±14.6)个,与阳性对照组[ (350.4±20.0)个]间差异均有统计学意义(P＜0.05);膜联蛋白V-碘化丙啶双染结果显示,caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组及caspase-3抑制剂组凋亡率分别为(38.87±3.31)％、( 25.57±2.20)％、(17.17±2.24)％和(14.73±2.48)％,与空白对照组及阳性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);caspase-3酶活性在caspase-8、caspase-9及caspase-8+caspase-9抑制剂组分别为0.1274±0.0076、0.1465±0.0062、0.1044±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 AGE-HAS主要通过激活caspase依赖性凋亡途径诱导HGF凋亡;其中死亡受体途径可能在凋亡过程中占主导地位.     

IL-1β对体外培养人牙髓成纤维细胞中基质金属蛋白酶-2的影响

目的:探讨白细胞介素-1β(interleukin-β,IL-1β)对体外培养的人牙髓成纤维细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metallproteinase-I,MMP-2)的影响。方法:利用免疫组化和明胶酶谱法,检测正常和经IL-1β刺激后的牙髓成纤维细胞中MMP-2的表达、分泌和活性。结果:MMP-2在正常和经IL-1β刺激后的牙髓成纤维细胞中均有表达,后者表达明显强于前者。明胶酶谱分析显示,与对照组相比,经IL-1β刺激的牙髓成纤维细胞中MMP-2的水平在48 h后持续显著升高。结论:IL-1β可能参与调节牙髓成纤维细胞合成和分泌MMP-2,从而促进牙髓炎症的发生。     

ADAM28反义核酸对人牙龈成纤维细胞生物学功能的影响

目的 研究金属蛋白酶解离素28（a disintegrin and metalloproteinase 28, ADAM28）反义核酸（antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN）对人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts, HGFs）增殖、分化、凋亡的影响,并分析可能的作用机制。方法 采用细胞培养、基因转染、四甲基唑蓝（MTT）比色法、酶动力学法和流式细胞术（FCM）检测ADAM28反义核酸转染HGFs后对细胞生物学特性的影响。采用SPSS16.0软件包中的SNK检验对数据进行统计学分析。结果 ADAM28 AS-ODN组HGFs的增殖活性显著降低。AS-ODN组HGFs处于S期的细胞百分比显著低于S-ODN组和未转染组,G₂+M期的细胞百分比显著低于未转染组,AS-ODN组的细胞增殖指数（PI=S+G₂M）显著低于其他2组,差异显著。AS-ODN组碱性磷酸酶（ALP）分泌活性、凋亡细胞百分比显著升高。结论 ADAM28 反义核酸可显著抑制HGFs的增殖,并影响细胞周期的变化,促进其分化,显著诱导HGFs的凋亡。     

缺氧对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物mRNA表达的影响

目的 探讨缺氧对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase,TIMP) mRNA表达的影响,以期为牙周组织修复再生机制研究提供依据.方法 组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,分为缺氧组和常氧组(对照组).缺氧组细胞分别于1％O2、5％ CO2、94％N2的37℃培养箱中培养12、24和48 h(分别为12、24、48 h缺氧组);常氧组细胞在20％O2、5％ CO2、75％N2的37℃培养箱中培养.采用反转录聚合酶链反应技术检测MMP和TIMP相关基因的表达.缺氧组与常氧组间均数比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验.结果 12、24、48 h缺氧组MMP-2 mRNA的表达呈明显递增趋势(分别为0.769±0.038、0.793±0.043、0.865±0.047),均显著高于常氧组(0.294±0.117),P＜0.01;12h缺氧组TIMP-1,2 mRNA的表达(分别为1.870±0.645、0.862±0.043)均有一过性升高,均分别显著高于常氧组TIMP-1,2 mRNA的表达(分别为0.816±0.043、0.426±0.097),P＜0.05.12h缺氧组MMP-1/TIMP-1 mRNA的比值(0.392±0.206)显著低于常氧组(0.859 ±0.126),P＜0.05;24、48 h缺氧组MMP-2/TIMP-2 mRNA的比值(分别为1.091±0.207、1.264±0.377)均显著高于常氧组(0.695±0.255),P＜0.05.结论 缺氧可以导致MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达,并使MMP-2 mRNA与TIMP-2 mRNA的比值失衡,这可能是缺氧导致牙周炎患者牙周组织破坏加重的机制之一.     

人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞的培养和生物学特征

目的：探讨采用不同方法建立体外培养人牙龈成纤维细胞和人牙周膜成纤维细胞并对其生物学特性作初步探讨。方法：分别采用消化培养法和组织块培养人的牙龈和牙周膜成纤维细胞。通过倒置显微镜活体观察，以及光镜、透射电镜、免疫组化和生长曲线等方法对其生物学特性作初步观察。结果：消化培养法成功率低于组织块培养法。光镜下和透射电镜下观察两种细胞在形态和结构上相似。免疫组化染色证实此两种细胞均来源于中胚层的纤维母细胞。生长曲线表明牙龈成纤维细胞的倍增时间比牙周膜成纤维细胞稍短，而牙周膜成纤维细胞的增殖活性比牙龈成纤维细胞高。结论：组织块培养法适用于此二种细胞的培养。细胞生物学特征方面有许多相似形，提示这两种细胞来于同一个细胞群。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶表达的影响

目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)表达水平的影响,探讨fimA基因型与Pg致病力之间的关系.方法 Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、WCSP115(Ⅱ型)、WCSP1.5(Ⅲ型)、W83(Ⅳ型)分别与牙龈成纤维细胞在标准条件下共同孵育(对照组为达尔伯克氏改良伊格尔培养基),于孵育后1、3、6和12 h收集细胞和培养上清液,应用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA法分别检测牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA及蛋白的动态表达.结果 与对照组相比,Pg刺激下牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA和蛋白水平表达量均明显上调(P<0.01);其中Ⅱ型fimA型Pg的刺激作用强于其他各型,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(28.88±3.12)～(231.01±24.99)、(1.35±0.17)～(3.08±1.20);MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(20.42±2.21)～(188.34±37.37)、(2.57±0.76)～(18.08±1.15),与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ型Pg的刺激作用较弱,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(5.11±0.55)～(72.84±8.84)]μg/L、[(0.68±0.13)～(1.46±0.94)]μg/L;MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(4.55±0.55)～(25.75±3.12)]μg/L、[(2.28±0.93)～(11.22±2.46)]μg/L,与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 Pg可以诱导牙龈成纤维细胞过表达MMP,fimA基因型与Pg的毒力作用相关,fimA型可能为Pg致病力差异的基因基础.     

糖基化终产物对人牙周膜细胞自噬的影响

摘要 目的：研究在体外培养坏境下糖基化终产物(advanced glycation end of products,AGEs)对人牙周膜细胞(hPDLCs)发生自噬现象的影响。方法 选取因正畸治疗而拔除的前磨牙,组织块法分离培养人牙周膜细胞,鉴定后传代培养。用不同浓度的AGEs处理hPDLCs,以单纯DMEM完全培养基作为阴性对照组,培养0、1、3、6、9h,透射电镜观察细胞自噬体数量的变化和形态,Western blot、免疫荧光法检测自噬蛋白LC3表达的改变,检测在体外培养坏境下AGEs对hPDLCs发生自噬现象的影响。结果 AGEs处理hPDLFs 0、1、3、6、9 h后,与对照组比较,实验组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达显著变化;与0h比较,1h时实验组与对照组自噬水平都明显下降,随时间变化对照组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ无明显改变,实验组在3 h时达到高峰,并随时间变化逐渐降低;3 h时电镜观察和免疫荧光检测到实验组细胞胞浆内自噬体数量增加。结论 AGEs能够提高hPDLFs的自噬水平。     

糖基化终产物对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨糖基化终产物在糖尿病牙周病形成中的作用。方法：原代培养牙周膜成纤维细胞,将糖基化终产物修饰的人血清白蛋白及未修饰人血清白蛋白与牙周膜成纤维细胞在体外共同培养,MTT法测定细胞增殖,用碱性磷酸酶测定法测定ALP。结果：糖基化终产物修饰的人血清白蛋白能以浓度依赖的方式抑制牙周膜细胞的增殖（p〈0.05）,而未修饰人血清白蛋白可使细胞增殖,但两种白蛋白均不诱导ALP的表达。结论：糖基化终产物可通过抑制牙周膜成纤维细胞的增殖,降低糖尿病病人牙周组织对损伤的修复能力,导致牙周病。     

糖基化终产物在牙周病中的作用

糖基化终产物(AGEs)是非酶性糖基化反应产生的一组异源性物质.AGEs在糖尿病患者的组织、血浆中蓄积是造成糖尿病慢性并发症原因之一.近年来亦发现AGEs与其受体作用的加强是糖尿病患者牙周病加重的发病机制之一.本文主要就AGEs及其受体在牙周病中的作用和相关机制作一概述.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

糖基化终产物及其受体对牙周膜成纤维细胞凋亡影响的实验研究

目的观察糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)促进糖基化终产物受体(receptor foradvanced glycation end products,RAGE)在大鼠牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLF)中的表达情况,并研究RAGE在大鼠PDLF凋亡中的作用。方法第3代大鼠PDLF在含有终浓度为200 mg/L的糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end products-bovine serum albumin,AGE-BSA)培养基内培养,根据孵育时间分为实验组A1、A2、A3、A4组;相同条件下PDLF于终浓度200 mg/L的BSA孵育,按与A1～A4组相同的孵育时间分为实验组B1、B2、B3、B4;在无AGE-BSA、BSA的培养基内培养第3代PDLF设为对照组C组。检测各组细胞活性、细胞凋亡情况、RAGE及细胞凋亡蛋白酶3 mRNA表达情况。结果 AGE干预的大鼠PDLF在细胞形态学及细胞活性检测方面均发生改变。相同时间点A、B各组细胞活性组间比较差异具有统计学意义(P<0.01),A1、A2、A3、A4 4组细胞活性的组间差异无统计学意义(F=2.353,P=0.088),B1、B2、B3、B4 4组的组间差异亦无统计学意义(F=0.468,P=0.706)。经流式细胞术检测,实验组A1、A2、A3、A4组细胞凋亡比例依次明显增高,与C组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。受AGE干预的细胞可以表达RAGE且细胞凋亡蛋白酶3表达阳性。结论 AGE可以刺激大鼠PDLF表达RAGE,促进细胞凋亡。     

Receptor for advanced glycation end products (RAGE)-expressing endothelial cells co-express AGE and S100 in human periapical granulomas

Objective

The engagement of the receptor for advanced glycation end products (RAGE) by AGE or S100 perturbs homeostatic mechanisms and provides a basis for cellular dysfunction in pathological situations. To assess the mechanism of vascular immune reactions in chronic periapical periodontitis, we analysed co-expression of RAGE and AGE or S100 in periapical granulomas.

Methods

Surgically removed periapical lesions, which had been diagnosed as chronic periodontitis, were inspected histologically using paraffin-embedded sections stained with haematoxylin and eosin. Cryostat sections of the tissues, which were identified histologically as periapical granulomas, were then examined by double immunohistochemistry using polyclonal antibodies raised against human CD34 and monoclonal antibodies specific for human RAGE, AGE or S100. Dual-colour immunofluorescence image analysis was also performed to assess the co-expression of RAGE and AGE or RAGE and S100 by endothelial cells.

Results

Marked expression of RAGE, AGE, and S100 by CD34⁺ endothelial cells was noted. Dual-colour immunofluorescence image analysis revealed that the RAGE-expressing endothelial cells co-expressed AGE and S100; however, the number of RAGE-AGE-expressing endothelial cells was significantly higher than that of RAGE-S100-expressing endothelial cells.

Conclusions

Co-expression of RAGE and AGE by endothelial cells in periapical granulomas is more relevant than that of RAGE and S100. The possible engagement of RAGE and AGE may trigger cellular activation and mediate tissue injury.     

晚期蛋白氧化产物对人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡及合成基质金属蛋白酶1的影响

目的 探讨晚期蛋白氧化产物(advanced oxidative protein products,AOPP)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGF)增殖、凋亡及合成基质金属蛋白酶1(matrix matelloproteinast-1,MMP-1)的影响,探讨AOPP在糖尿病患者牙周病加重中的作用及其介导氧化应激的可能机制.方法 采用酶消化.组织块培养法获得HGF,在对照组中加入不含AOPP-人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的培养基,在实验组中分别加入含有5、50、100 mg/L AOPP-HSA的培养基,甲基嚷唑基四唑(MTT)比色法检测在不同时间段下HGF增殖水平的变化;ELISA法测定HGF合成MMP-1的水平;与含50 mg/L AOPP-HSA培养基共培养72 h,经膜联蛋白V/PI双染后,流式细胞仪检测HGF的凋亡状况.结果 5、50、100 mg/L AOPP-HSA组对HGF增殖抑制率与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),并在共培养的48 h达到峰值[分别为(19.01±6.28)%、(30.48±5.75)%、(39.75±4.60)%],呈浓度依赖关系;各实验组HGF的凋亡率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);共培养72 h后,0.5、5、50、100 mg/L AOPP.HAS组中MMP-1合成量[分别为(55.61±1.06)、(65.78±4.04)、(79.24±3.09)、(89.76±28.88)mg/L]均高于对照组[(34.90±3.15)mg/L,P＜0.05],MMP-1水平与AOPP-HSA呈浓度依赖关系.结论 AOPP能抑制成纤维细胞增值,该抑制作用不是通过诱导细胞凋亡来实现;AOPP可增加MMP-1的合成,促进胶原溶解,加速牙周病进程.